外植体的选取与处理

实验实训五　外植体的选取与处理

一、实验实训目的

学会外植体的选择和处理方法，掌握选择表面灭菌剂的要求，熟练掌握外植体的灭菌方法。

二、实验实训原理

接种用的材料表面，常常附有多种多样的微生物，这些微生物一旦带进培养基，就会迅速滋生，使实验前功尽弃。因此，材料在接种前必须进行灭菌。灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不能伤及材料。

经常使用的灭菌剂有酒精（70%～75%）、次氯酸钠、过氧化氢、漂白粉、溴水和低浓度的氯化汞等。使用这些灭菌剂，都能起到表面杀菌的作用。但氯化汞灭菌后，汞离子在材料上不易去掉，必须将材料用无菌水清洗多次。

消毒剂的种类不同，消毒灭菌的效果也不同。因此，选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒、灭菌作用，又要使用易被蒸馏水冲洗干净或能自行分解的物质。使用时需要考虑使用浓度和处理时间。

三、实验实训仪器、用具及试剂

（一）实验实训仪器、器皿及用具

接种工具、无菌杯、烧杯、外植体材料、培养皿、培养基、脱脂棉、手推车、剪刀、镊子、洗衣粉、毛笔、工作服、拖鞋、记号笔、香皂。

（二）试剂

70%的酒精、2.0%的次氯酸钠、10%的次氯酸钙、0.1%的氯化汞、无菌水。

四、实验实训步骤

（一）外植体的采集

春夏季节，选择健壮、无病虫害症状的外植体，取材部位最好是幼龄植株的幼嫩部位。

（二）外植体的预处理

去掉外植体不用的部位，剩余部分按培养要求剪成大小合适的材料。将材料刷洗干净，置于流水下冲洗6～24 h（因材料种类不同而定）。

（三）外植体的灭菌

在超净工作台上进行，把培养材料放进70%的酒精中浸泡约30 s，再在0.1%的氯化汞中浸泡10 min，或在10% 的漂白粉清液中浸泡10～l5 min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触，然后用无菌水冲洗3～5次。

花药的灭菌，果实及种子的灭菌，茎尖、茎段、叶柄及叶片的灭菌，根和贮藏器官的消毒参见本项目中任务四的相关内容。

【知识拓展】

外植体进行消毒时的注意事项：

（1）表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡；

（2）在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗；

（3）与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收；

（4）若外植体污染严重则应先用流水漂洗1 h以上或先用种子培养得到无菌种苗，然后用其相应部分进行组织培养；

（5）氯化汞消毒效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗材料至少5 次，而且要对氯化汞进行回收。

植物组织培养中常用的消毒剂如表2-9所示。

表2-9　植物组织培养中常用的消毒剂

如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，且生长正常，即可认为消毒时间适宜。

五、作　业

将本次实验实训内容整理成实验实训报告。

思考与练习

1.培养基的主要成分有哪些？各有何作用？

2.说出至少4种常见培养基的名称，各有什么特点？

3.培养基的母液如何进行保存？

4.培养基的分装与灭菌各有哪些注意事项？

5.培养基的母液分为哪几大类？

6.如何对外植体材料进行消毒灭菌处理？

7.对外植体材料进行消毒灭菌应注意哪些问题？