草莓脱毒原种苗的繁育

（四）草莓脱毒原种苗的繁育

1.配制培养基

培养基是植物组织离体培养的重要物质基础，被称作“白色土壤”，按其形态分为固体培养基和液体培养基，固体培养基即在培养液中加入一定量的凝固剂如琼脂。草莓组织培养多采用固体培养基。培养基从成分上可分为基本培养基和附加部分，基本培养基是前人经过试验获得的较理想的营养配方，有很多种。例如MS培养基、WPM培养基、White培养基、N6培养基等。包括大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机元素等。附加部分是培养者根据离体材料的不同而加入的部分，大多为各种激素。草莓组织培养时常采用MS培养基、1/2MS培养基和White培养基为基本培养基。所用激素有6-BA、NAA、IAA、GA3、IBA等。

草莓茎尖诱导时可在培养1/2MS+6-BA0.5毫克/升+ GA30.1毫克/升+IBA0.2毫克/升中进行；继代培养可在MS+6-BA0.5～1毫克/升中进行，生根在1/2MS+IBA0.2～1毫克/升或1/2MS+IAA0.5～1毫克/升中进行。蔗糖30克/升，琼脂7～8克/升。

（1）配制母液

母液分为基本培养基母液和植物生长调节剂母液。通常基本培养基母液的浓度是培养基浓度的10倍、100倍或更高。无机盐类的母液可以在2～4℃冰箱中保存。维生素等有机营养的母液要在冷冻箱内保存，在使用前取出，温水中溶解后取用。配制母液时，应该把Ca²⁺与SO₄²-、Ca²⁺与PO₄³-放在不同的母液中，以免发生沉淀。MS培养基母液配方见表4-1。配制母液的数量可以根据实际情况而定，如MS培养基通常可以配制三液式、四液式或五液式等。一般情况下，大量元素、微量元素、有机元素、钙盐、铁盐分别配制母液。配置好的母液，在瓶上注明母液号、配制倍数、日期。发现有霉菌或沉淀变质时，应该重新配制。配制植物生长及母液时，有毫克/升（mg/L）和毫摩尔/升（mmol/L）两种浓度单位供选择。摩尔单位直接代表每升溶液中的分子数，这使得不同生长剂之间具有可比性。此外，在国际性刊物中，摩尔单位是通用单位。植物生长调节剂母液通常用1～10毫摩尔/升，这样的浓度既便于计算也

表4-1　MS培养基母液配方

可以避免冷藏时结晶。由于多数生长调节剂物质难溶于水，因此配法各不相同。NAA可溶于热水或少量95%酒精中；2，4-D、IAA、IBA、GA3和ZT可先用少量95%酒精溶解后再定容，摇匀后贮藏于试剂瓶中，贴上标签，放在2～4℃冰箱中保存。

（2）制备培养基

制备培养基的具体步骤如下：

①取出母液并按顺序放好，经有机营养物质母液溶化待用。将洁净的各种玻璃器皿如量筒、烧杯、移液管和玻璃棒等放在指定位置；

②取一只烧杯，放入1/3左右（配制培养基总量的1/3左右）纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌；

③加入植物生长调节剂和蔗糖（30克/升），待糖溶解后定容；

④将定容的培养基倒入容器中，加入琼脂（7～10克/升），并加热使其完全溶解；

⑤调整pH，用预先配好的氢氧化钠或稀盐酸进行调整；

⑥将培养基分装到培养瓶中，装入量为培养瓶总容量的1/5～1/3，封好瓶口；

⑦灭菌，用高压锅灭菌（121℃，15～20分钟）或过滤除菌；

⑧灭菌后待高压锅温度降至50℃以下时，便可取出、冷却凝固后待用。

2.外植体的采集

在草莓匍匐茎发生最多的季节，剪取5厘米左右的顶梢，剪去叶片，用自来水冲洗干净。

3.外植体灭菌与接种

在超净工作台上，用70%酒精浸蘸3～5秒，用0.1%～0.2%的氯化汞或6%～8%次氯酸钠灭菌2～10分钟，用无菌水冲洗3～4次后，用解剖针剥去茎尖外面的幼叶和鳞片，露出生长点，切取带有1～2个叶原基（0.3～0.5毫米）大小的茎尖接种到预先制备好的培养基中。

4.离体培养

将已接种的培养瓶置于25～28℃、光照为2000勒克斯、每天光照10小时的无菌培养室中（培养室常采用定期熏蒸灭菌的方法）。经10～15天，外植体开始萌发，再过7～10天，外植体周围会产生很多小芽形成芽丛，接着芽丛萌发，约经80天左右瓶内无根苗长到3～4厘米时，就可进行继代培养了。

将初代培养的无根苗切分成带3～4个芽的芽丛，接种到继代培养基上进行增殖培养，一般一个月左右可进行一次。

当继代苗长到3～4厘米时，同样切分成带3～4个芽的芽丛，接种到生根培养基上，大约30天左右可长出大量白色的不定根。也可将继代苗取出洗净，扦插到珍珠岩内生根，在18～20℃温度下，大约20天可长出3～4条1.5～2.5厘米长的根。此时应注意保湿。

5.温室炼苗

温室内准备好苗床，苗床上应选用疏松、透气性好、富有一定养分的营养土，并要经过消毒，也可使用5厘米×5厘米营养钵内装营养土。温室要有防蚜虫措施，以防感染病毒。生根的瓶苗要在组培室中开口1～2天，以适应室内环境。栽植时，应用镊子夹住草莓叶从培养瓶中轻轻拉出，在清水（或600倍多菌灵液）中洗净附着的培养基，再将苗栽植到苗床或营养钵中。注意培养基一定要洗净，否则会造成病菌大量繁殖，影响成活。栽后应立即灌透水，栽植初期应覆膜保湿，以后逐渐增加放风时间，随着苗木生长和对温室环境的适应，逐渐将膜撤除。脱毒苗经过2个月左右的温室驯化锻炼和生长，可长成具有3片以上展开叶、5条以上长达5厘米左右根系，此时即可作为原种苗定植到生产苗繁育圃，也可在有保护或隔离条件下经过1～2代扩繁，将其匍匐茎苗作为原种苗定植。