微柱凝胶免疫检测技术

实训六　输血检查

实训目的

选择用于患者的血液或血液制品，使输入的成分能在受者体内有效存活，无不良反应。要求输入的红细胞在受者体内必须不凝集和不溶血，输入的血浆不导致患者自身红细胞显著破坏。

实训内容

1.ABO血型正反定型。

2.Rh(D)定型。

3.抗体筛检和鉴定。

4.交叉配合试验。

实训方法

一、标本的采集和处理

离心标本，分离出受检者血清。取受检者红细胞配制成3%～5%红细胞盐水悬液。

二、实验步骤

(一)ABO血型正反定型

1.盐水法ABO正反定型

(1)查抗原：取洁净小试管3支，分别标明抗A、抗B和抗A+B(O型血)，用滴管分别加抗A、抗B和抗A+B 分型血清(O型血)各2滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者3%～5%红细胞盐水悬液一滴，混合。

(2)查抗体：另取洁净小试管3支分别标明A、B、O型细胞，用滴管分别加入受检者血清1～2滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B、O型3%～5%试剂红细胞悬液1滴混匀。

(3)以120 g离心1分钟或1 300 g离心15秒。

(4)将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起。先以肉眼观察有无凝集(溶血)现象，如肉眼不见凝集，应将反应物倒在玻片上，再以低倍镜检查。

(5)观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于A、B亚型的发现。

2.试管法做A亚型检测

(1)取洁净试管三个，一个供测定受检者红细胞，另两个供对照用，后者标明A1和A2。

(2)将抗A1分型血清分别滴在受检者试管内和对照的A1管、A2管内各1滴。

(3)分别将受检者红细胞悬液以及对照用A1和A2红细胞悬液1滴，滴在相应的三个试管内，混匀。

(4)以120 g离心1分钟或1 300 g离心15秒。

(5)将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起先以肉眼观察有无凝集(溶血)现象，如肉眼不见凝集，应将反应物倒在玻片上，再以低倍镜检查。

(二)Rh(D)定型

1.盐水试管法

(1)取三只干净一次性试管，分别标记阳性对照、阴性对照和受检管，每管加入2滴抗D试剂(IgM或IgG+IgM)。

(2)受检管加1滴3%～5%受检红细胞生理盐水悬液，阳性对照管加Rh(D)阳性红细胞，阴性对照管加Rh阴性红细胞各1滴。

(3)混匀后，120 g离心1分钟或1 300 g离心15秒。

(4)轻轻振荡，悬浮沉积细胞，肉眼观察凝集反应。若结果仍为阴性，需进一步检测弱D表型抗原。

2.Rh(D)阴性血型确认实验

(1)取试管3支，分别加入三种批号的抗D血清2滴和受检者3%～5%红细胞盐水悬液1滴，37 ℃水浴孵育30～60分钟。

(2)以120 g离心1分钟或1 300 g离心15秒，肉眼观察溶血和凝集，并记录结果。

(3)再彻底悬浮细胞，用盐水洗涤3次，最后一次洗涤后将上清液去除，并用滤纸将附着于管口的盐水吸去。再加生理盐水1滴，混匀。

(4)按试剂说明加抗球蛋白试剂2滴，充分混合。

(5)以120 g离心1分钟或1 300 g离心18秒，轻轻悬浮细胞，观察结果并镜检。

(6)如结果为阴性，就加IGg包被的细胞1滴，离心并观察结果。如果还不见凝集，表示抗球蛋白试剂无效，必须重做。

(7)结果判定：受检红细胞与三批抗D血清在间接抗人球蛋白试剂中有一种批号发生凝集者，都属于弱D型。若和三种批号都不发生凝集,则确认为Rh(D)阴性。

(三)抗体筛检和鉴定

1.抗体筛选(MP法)

(1)根据标本量，对标本进行编号，依次取相同数量的试管进行编号。试管内对应加2滴病人血清(或血浆)。

(2)分别加入3%～5%筛选细胞(3人份混合的O型细胞)1滴。

(3)加LIM 0.6 ml，混合均匀(参见凝聚胺试剂说明书)。

(4)加2滴Polybrene Solution，混合后静置15秒。

(5)离心3 400转/分钟，60秒，然后把上清液倒掉。

(6)目测红细胞有无变成凝块(即聚合反应)，如果没有凝块，则必须重做。

(7)加2滴Resuspending Solution，并轻轻混合。若为Polybrene引起的非免疫性聚合，应在1分钟内会散开。若是特异性抗体引起的凝集，就不散开。

(8)可进一步倒在玻片上用显微镜观察有无凝集。如有凝集，即为抗体筛选阳性；无凝集反应，即为抗体筛选试验阴性。

2.抗体鉴定

(1)按照谱细胞试剂盒说明书进行操作。取一次性试管，根据谱细胞的试剂细胞编号，对应进行试管的编号，分别加入2滴待检血清(或血浆)。

(2)盐水法：分别对应加入3%～5%试剂细胞悬液1滴，混匀，离心3 000转/分钟，18秒，观察结果并记录各试剂细胞有无凝集，以及凝集强弱。

(3)抗球蛋白法：将上述各试管摇匀，放入37 ℃水浴箱，致敏30分钟后，用生理盐水洗涤三次，倾去上清液，沥干。

(4)每管加抗球蛋白试剂2滴，混匀，离心3 000转/分钟，18秒，取出，轻摇，观察凝集结果。对目测不到的凝集或弱凝集需镜检，并记录结果。

(5)根据盐水法和抗球蛋白法两组实验结果，结合谱细胞试剂盒提供的“红细胞血型抗体鉴定细胞反应格局表-谱细胞”，进行结果分析，从而推断不规则抗体的种类名称。

(四)交叉配合试验

1.配血

(1)主侧加病人血清(浆)2滴，加献血者3%～5%红细胞悬液1滴，次侧加献血者血清2滴，加病人3%～5%红细胞悬液1滴。

(2)将主次侧管3 000转/分钟，离心15秒，取出，肉眼观察是否溶血，有无凝集现象。

(3)在肉眼观察过凝集的主次侧管内，每管加LIM溶液0.6 ml，混合均匀，室温孵育1分钟。

(4)每管各加2滴聚凝胺溶液，混合后静置15秒。

(5)离心3 000转/分钟，60秒，倾去上清液，不再悬浮细胞扣。

(6)质量控制：轻轻摇动试管，目测细胞有无凝集。如无凝集，必须重做。

(7)加入2滴重新悬浮液，并轻轻混合，低倍镜下观察结果。

(8)结果判定：如凝集散开，并在显微镜下观察无凝集，则为聚凝胺引起的非特异性凝集，为配血相合；如凝集不散开，显微镜下观察有凝集，则为抗原抗体结合的特异性反应，为配血不相合。

2.抗球蛋白法配血

(1)取两支试管，分别标明主侧和次侧，主侧管加病人血清2滴和献血者3%红细胞盐水悬液1滴，次侧管加献血者血清2滴和病人3%红细胞悬液1滴。

(2)混合置37 ℃水浴致敏30分钟，取出后用盐水洗涤红细胞3次，倾去上清液，沥干。

(3)每管加抗球蛋白试剂2滴，混匀，离心3 000转/分钟，15秒，取出，轻摇，观察结果。

(4)阳性对照：3%不完全抗D致敏的Rh阳性红细胞悬液1滴，加抗球蛋白血清1滴；阴性对照：3%正常AB型血清致敏Rh阳性红细胞悬液1滴，加抗球蛋白血清1滴；盐水对照：献血者3%红细胞盐水悬液1滴加等渗盐水1滴，另一管受血者3%红细胞盐水悬液1滴加等渗盐水1滴。

(5)结果判定：镜检观察，如阳性对照管凝集，阴性对照管盐水不凝集，主、次侧配血管都不凝集，表示无输血禁忌；如果有一侧发生凝集，都表明有输血禁忌，记录结果。

三、微柱凝胶免疫检测技术

操作见附6.1、附6.2。

实训结果

填写或粘贴检验报告单。

实训思考

1.溶血标本对实验结果有何影响？

2.试分析引起血型免疫凝集试验的假阳性及假阴性的因素。

(张建军　曹元应)

【附6.1】　FYQ型免疫微柱孵育器操作流程

1.打开电源开关，液晶屏显示“Chang Chun Bo Yan”(长春博研)，3秒后显示“Heating XX.XX ℃”(加温)，待温度升到37.0 ℃时显示“15:00 37.00 ℃”(初始时间设定为15分钟；孵育温度37 ℃)并伴有提示音提示孵育温度已到，打开上盖板放入免疫微柱凝胶卡，合上盖板。

2.按需要设定孵育时间，触按“时间上移键”依次递增3分钟，触按“时间下移键”依次递减3分钟。

3.时间设定后，触按“运行”键开始倒计时运行。孵育时间到后，液晶屏显示“15:00 37.00 ℃”，同时伴有提示音。

4.触按“复位”键，恢复初始状态。

【附6.2】　TD-3A型血型血清学用离心机操作流程

1.连接电缆，打开电源开关，液晶屏显示“Chang Chun Bo Yan”(长春博研)。数秒后，门锁自动打开，液晶屏显示“Lid is open”(请开盖)。

2.将装有微柱凝胶卡的转子放在电机轴上，然后盖好上盖，盖锁关闭，液晶屏显示第一级程序：“1 0900　02:00”。

3.触按“运行”键，电机旋转开始运行。当第一级程序“1 0900　02:00”运行完，接着运行第二级程序：“2 1500　03:00”。工作结束后，液晶屏显示“Lid is open”(请开盖)，盖锁自动打开，并伴有提示音。

4.结果观察。

(张建军　曹元应)