色谱柱的评价

一、目的及要求

1.了解高效液相色谱仪的工作原理。

2.学习评价液相色谱反相柱的方法。

二、实验原理

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的，而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。

评价色谱柱的性能参数主要有四个。

（1）柱效（理论塔板数）n

n＝5.54（tR／W1／2）2

式中，tR为测试物的保留时间；W1／2为色谱峰的半峰宽。

（2）容量因子k′

k′＝（tR－t0）／t0

式中，t0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。

（3）相对保留值（选择因子）α

α＝k′2／k′1

式中，k′1和k′2分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。

（4）分离度Rs

Rs＝2（tR2－tR1）／（Wb1＋Wb2）

式中，tR1，tR2分别为相邻两峰的保留时间；Wb1，Wb2分别为两峰的底宽，对于高斯峰来讲，Wb＝1.70W1／2。

为达到好的分离，我们希望n、α和Rs值尽可能大。一般的分离（如α＝1.2，Rs＝1.5），需n达到2 000。柱压一般为104kPa或更小一些。本实验采用多核芳烃作测试物，尿嘧啶为死时间标记物，评价反相色谱柱。

三、仪器与试剂

1.仪器

Agilent LC1200高效液相色谱仪（由G1311A（四元泵），进样器，VWD检测器和记录系统组成）

色谱柱：5 cm×4.6 mm I.D.，Kromasil-C18H37（ODS），10μm

超声波发生器

溶剂过滤器

2.试剂

流动相：甲醇／水（80／20）

乙腈／水（80／20）

0.45μm耐有机溶剂微滤膜

样品Ⅰ：含尿嘧啶（0.010 mg·mL－1）、萘（0.010 mg·mL－1）、联苯（0.010 mg·mL－1）、菲（0.006 mg·mL－1）的甲醇混合溶液

样品Ⅱ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液，溶液浓度约为0.01 mg·mL－1

样品Ⅲ：NaH2PO4（0.10 mg·mL－1），癸烷基苯磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十四烷基苯磺酸钠、十六烷基苯磺酸钠（各0.010 mg·mL－1）及混合溶液（0.010 mg·mL－1）

四、实验步骤

1.准备流动相。将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200 mL溶液，混合均匀经超声波脱气并过滤后加入仪器贮液瓶中。

2.检查电路连接和液路连接正确以后，接通高压泵、检测器和控制系统电源。设定操作条件为：流速0.6～0.8 mL·min－1，压力上限3 000 psi，检测波长254 nm（该仪器检测波长可调），记录基线。并调节基线到合适位置。

3.观察检测器的读数显示并观察计算机显示窗口，待基线平稳后，将进样阀手柄拨到“Load”的位置，使用专用的液相色谱微量注射器取5μL样品注入色谱仪进样口，然后将手柄拨到“Inject”位置，记录色谱图。

4.重复3的操作两次。

5.用同样方法进纯样品的甲醇溶液，确定出峰顺序。

6.根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽，然后计算色谱柱参数n、k′以及相邻两峰的α、Rs。

7.将表面活性剂水溶液逐一进样，探索各组分的色谱分离条件，确定折中条件分析混合样品。

8.将流速降为0，待压力降为0后关机。

五、思考题

1.高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点？

2.选择色谱流动相应从哪几个方面进行考虑？

3.如何保护色谱柱以延长其使用寿命？