实训38 水的卫生学检验
一、实训目的
（1）学习并掌握水样采取方法和水样细菌总数、大肠菌群数量测定方法。
（2）学习并掌握平板菌落计数的方法和原则，多管发酵法测定大肠菌群数量的方法。
（3）了解水质状况与细菌数量和大肠菌群数量的关系。
二、实训原理
本实训应用平板菌落计数法来测定水中细菌总数。平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上形成的菌落是由单细胞繁殖而成的现象来进行的，一个菌落即代表一个单细胞。先将待测样品作一系列稀释，再取一定量稀释菌液接种于培养皿中，使其均匀分布于培养基内，经培养后，统计菌落数目，即可换算出样品中所含的菌数。平板菌落计数法可测出样品中的活菌数，它应用于某些成品的检定，生物制品检定及食品、药品、水源污染程度检定等方面。
生活用水水源常被生活污水、工业废水或人和动物的粪便所污染。粪便污物含有腐生性和病原性微生物，前者对人无害，后者则会引起传染病。测定水样是否合乎饮用水标准，通常需测定细菌总数（菌落总数）和总大肠菌群数两个项目。水中细菌总数可说明水被有机物污染的程度。细菌总数越多，有机物质含量越大。细菌总数（菌落总数）是指1 mL水样在营养琼脂培养基上，37℃经48h培养后所生长的菌落总数。总大肠菌群是指一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性无芽孢的杆状细菌，在乳糖培养基中经37℃24～48h培养能产酸产气，是大量出现在粪便中的非病原菌。根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。大肠菌群数是指每100mL水中含有的大肠菌群近似值。
总大肠菌群数测定采用多管发酵法，包括初发酵试验、平板分离和证实试验三个部分。
初发酵试验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小倒管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h内小倒管中有气体生成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气。此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟到48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分试验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结果。
平板分离：平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂（EMB培养基）。前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色菌落，亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝两种染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。初发酵管24h内产气和48h产气的均需在以上平板上划线分离菌落。
证实试验：以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气或产气不产酸的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
自来水的国家卫生标准：细菌总数不得超过100CFU／mL，总大肠菌群数不得超过3个／L。
纯净水是以符合生活饮用水卫生标准的水为原料，通过电渗析法、离子交换法、反渗透法、蒸馏法及其他适当的加工方法制得的，密封于容器中且不含任何添加物可直接饮用的水。纯净水的国家卫生标准：菌落总数≤20CFU／mL，总大肠菌群数≤3MPN／（100 mL），致病菌（指肠道致病菌和致病性球菌）不得检出，霉菌和酵母菌不得检出。
三、实训器材
1．设备
超净工作台，电炉，高压蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，微波炉，菌落计数器，放大镜，生化培养箱。
2．仪器与用具
φ90mm培养皿，锥形瓶（250mL、500mL），吸管（1mL、10mL），试管，烧杯，玻璃棒，量筒，记号笔。
3．培养基与试剂
营养琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养液，伊红美蓝琼脂培养基，NaCl。
4．检验样品
自来水，纯净水，矿泉水，环境中水（池水、湖水、河水等）。
四、实训步骤
（一）实训准备
1．选择自来水、纯净水或矿泉水检验
（1）250mL具塞玻璃瓶1个，包扎。
（2）营养琼脂培养基100mL 1瓶，包扎。
依照营养琼脂培养基试剂瓶上的说明方法配制。
（3）10mL二倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管5支，倒置小倒管，包扎。
乳糖蛋白胨培养液的配方：蛋白胨10g；牛肉膏3g；乳糖5g；NaCl 5g；16g／L溴甲酚紫乙醇溶液1mL；蒸馏水1000mL；pH 7．2～7．4。
乳糖蛋白胨培养液的配制：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及NaCl溶于蒸馏水中，调pH 7．2～7．4，加入16g／L溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于有小倒管的试管中。
二倍浓缩乳糖蛋白胨的配制：按上述乳糖蛋白胨培养液配方，除蒸馏水，其他成分加倍。
（4）φ90mm培养皿5个，包扎。
（5）1mL吸管1支，10mL吸管1支，分别包扎。
（6）100mL量筒1个，包扎。
（7）50mL 3%Na2S2O3溶液1瓶，包扎。
（8）伊红美蓝琼脂培养基100mL 1瓶，包扎。
依照伊红美蓝琼脂培养基试剂瓶上说明方法配制。
其中，（1）、（2）、（4）、（5）、（6）、（7）、（8）准备好后，置于121℃高压灭菌20min，（3）置于115℃高压灭菌20min。
2．选择环境中水（池水、湖水、河水等）检验
（1）250mL具塞玻璃瓶1个，包扎。
（2）营养琼脂培养基200mL 1瓶，包扎。
（3）二倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管5支；10mL普通浓度乳糖蛋白胨发酵管10支，倒置小倒管，包扎。普通浓度乳糖蛋白胨培养液的配制按乳糖蛋白胨培养液的配方配制。
（4）φ90mm培养皿10个，包扎。
（5）1mL吸管4支，10mL吸管2支，分别包扎。
（6）试管4支，包扎。
（7）装100mL生理盐水的锥形瓶1瓶，包扎。
（8）伊红美蓝琼脂培养基100mL 1瓶，包扎。
其中，（1）、（2）、（4）、（5）、（6）、（7）、（8）准备好后，置于121℃高压灭菌20min，（3）置于115℃高压灭菌20min。
（二）操作步骤
1．自来水、纯净水或矿泉水检验
1）水样采取
自来水：先将自来水龙头用火焰灼烧灭菌或用75%酒精棉擦拭，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌锥形瓶接取水样400mL，加3%Na2S2O3溶液0．8mL去除残余的氯。
纯净水或矿泉水：以灭菌锥形瓶接取办公室饮水机水样400mL，或取市售瓶装纯净水或矿泉水检测。
2）细菌总数（菌落总数）测定
（1）用1mL灭菌吸管吸取1mL水样，注入灭菌培养皿中，共做两个培养皿。
（2）分别倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，立即在桌上做平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
（3）另取一空的灭菌培养皿，倾注已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基约15 mL，作空白对照。
（4）培养基凝固后，倒置于（36±1）℃培养箱中，培养48h，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为1mL水样的细菌总数。
3）菌落计数的原则
（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养基作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（表3－25例1）。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按二者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应报告二者的平均数；若大于或等于2，则报告其中稀释度较小的菌落总数（表3－25例2～例4）。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（表3－25例5）。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（表3－25例6）。
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（表3－25例7）。
（7）若各稀释级的平均平板菌落数均无菌落生长，则以未检出报告。
（8）若所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数出其中2个平板1cm2中的菌落数，除以2求出1cm2内平均菌落数，乘以皿底面积63．6cm2，再乘以其稀释倍数报告。
（9）菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，两位有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为了缩短数字，后面的零数也可用科学计数法来表示。
表3－25 稀释度选择及菌落总数报告方式举例
4）总大肠菌群测定
采用多管发酵法，包括初发酵试验、平板分离和证实试验三个部分。
（1）初发酵试验：分别吸取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨发酵管中，共接种5管。置于（36±1）℃培养箱中培养（24±2）h，若所有乳糖蛋白胨发酵管都不产气产酸，则报告总大肠菌群阴性，如有产酸或产气者，按下列步骤进行。
（2）平板分离：经24h培养后，将产酸产气或产气不产酸的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，于（36±1）℃下培养18～24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检和证实试验。
①深紫黑色、有金属光泽的菌落。
②紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落。
③淡紫红色、中心颜色较深的菌落。
（3）证实试验：经涂片、革兰氏染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落同时接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个，（36±1）℃培养（24±2）h，结果若产酸又产气，即证实有总大肠菌群存在。再根据证实为总大肠菌群的阳性管数查表3－26，即得每100mL水样中总大肠菌群最可能数（MPN）值。
表3－26 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合的最可能数
2．环境中水（池水、湖水、河水等）检验
1）水样采取
应取距水面10～15cm的深层水样，先将灭菌的带塞瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去瓶塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。
2）细菌总数测定
（1）稀释水样：无菌操作，将灭菌生理盐水分装于3支灭菌试管中，每支9mL，然后吸取1mL水样注入第一管9mL无菌生理盐水中，摇匀，再自第一管吸取1mL至下一管无菌生理盐水中，如此稀释到第三管，稀释度分别为10－1、10－2、10－3。每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适。若三个稀释度的菌落均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样取10－1、10－2、10－3三个连续稀释度，污染严重的水样取10－2、10－3、10－4三个连续稀释度。
（2）加样：自最后三个稀释度的试管中各吸取1mL稀释液加入灭菌培养皿中，每个稀释度做两个培养皿。另吸取灭菌生理盐水1mL加入另一空的灭菌培养皿中，同时做空白对照。
（3）倒培养基：各倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，立即在桌上做平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
（4）培养：待培养基凝固后，倒置于（36±1）℃培养箱中，培养48h。
3）菌落计数的原则
菌落计数的原则和方法同自来水、纯净水或矿泉水检验。
4）总大肠菌群测定
采用多管发酵法，包括初发酵试验、平板分离和证实试验三个部分。
（1）分别吸取10mL原水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨发酵管中，吸取1mL原水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨发酵管中，吸取1mL 10－1水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨发酵管中，每个稀释度接种5管。若环境中水污染严重，应加大稀释度，可接种原水样、10－1水样、10－2水样各1mL到10mL单料乳糖蛋白胨发酵管中，每个稀释度接种5管。甚至接种10－1水样、10－2水样、10－3水样各1mL到10mL单料乳糖蛋白胨发酵管中，每个稀释度接种5管。
（2）以下步骤同自来水、纯净水或矿泉水检验的平板分离和证实试验。
（3）根据证实为总大肠菌群的阳性管数查表3－27，即为每100mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。
表3－27 总大肠菌群检索表
续表
续表
续表
注1：本表采用3个稀释度（10mL、1mL和0．1mL），每个稀释度接种5管。
注2：表内所列检样量如改用1mL、0．1mL和0．01mL时，表内数字应相应乘以10；如改用0．1mL、0．01mL、0．001mL时，则表内数字应相应乘以100，其余类推。
五、结果记录
1．自来水、纯净水或矿泉水检测数据及计算结果记录
（1）细菌总数（表3－28）。
表3－28 自来水、纯净水或矿泉水细菌总数
（2）总大肠菌群数。
5个10mL双料乳糖蛋白胨发酵管中阳性管数是多少？查表3－26得每100mL水样中总大肠菌群最可能数（MPN）是多少？
（3）结论。
所检测的自来水、纯净水或矿泉水是否达到国家规定的卫生标准？
2．环境中水（池水、湖水、河水等）检测数据及计算结果记录
（1）细菌总数（表3－29）。
表3－29 环境中水的细菌总数
（2）总大肠菌群数（表3－30）。
表3－30 环境中水的总大肠菌群阳性管数
查表3－27得每100mL水样中总大肠菌群最可能数是多少？
（3）结论。
所检测的环境中水（池水、湖水、河水等）是否达到国家规定的饮用水标准？其污秽程度如何？
六、思考题
（1）总大肠菌群的定义是什么？为什么要选择总大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指标菌？
（2）伊红美蓝（EMB）琼脂培养基含有哪几种主要成分？在检查总大肠菌群时各起什么作用？
（3）水中细菌总数的测定为什么要同时做空白对照？
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