培养细胞的常规检查

项目八　培养细胞的常规检查

一、项目背景

细胞培养后，需要对其生长状况、形态甚至生物学性状连续地进行观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的组成及功能。细胞接种或传代后，实验者要定时根据细胞种类和实验要求对细胞做常规检查，如观察培养液pH值（颜色变化）、清亮度（是否污染）和细胞生长状态等，随时掌握细胞动态变化，如发现异常情况须及时处理。

二、项目目标

（1）掌握体外培养细胞的常规检查方法；

（2）掌握细胞生长曲线的绘制方法；

（3）能针对实验结果，对细胞的生长情况进行分析与处理。

三、工作流程

流程一：工作准备

续表

流程二：观察颜色、细胞换液

（1）用精密pH计测定培养液pH值，新鲜的培养液呈橙红色（pH 7.2左右）。正常培养若干天的培养液变黄，判断pH值是否下降；若颜色变紫，判断pH值是否升高。

（2）健康细胞和衰老细胞的观察对比。

光学显微镜下生长状态良好的细胞均质、明亮、透明度大、折光性强，相差显微镜下可以看清细胞的形态结构，细胞质中有粗大的线粒体颗粒和核。在细胞衰老、机能不良时，细胞质中常出现黑色颗粒、空泡或脂滴，细胞间隙加大，细胞形态变得不规则或失去原有特性。只有生长状态良好的健康细胞才宜进行实验。

根据观察，比较出健康细胞和衰老细胞明显不同之处。

（3）培养液全换操作：

①工作台面上放一块较干的酒精棉球，翻转培养瓶，使细胞面朝上；

②瓶口用火焰消毒后倒去原培养液；

③用干酒精棉球吸去瓶口残留液滴（注意瓶口液滴不能流回瓶内）；

④从培养瓶侧面加入新培养液（若瓶口留有少量培养液，用干酒精棉球擦去，再迅速通过火焰去除残留酒精）；

⑤从瓶侧面加入新培养液，再翻转培养瓶，使得培养液覆盖细胞面，瓶口消毒，加塞。

（4）培养液半量更换操作：

①瓶口消毒；

②从瓶侧面吸去原培养液量的一半；

③从瓶侧面补加等体积新培养液；

④翻转培养瓶，使得培养液覆盖细胞面，瓶口消毒，加塞。

流程三：细胞生长曲线的测定

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要手段。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，细胞生长曲线的绘制是最基本的内容。细胞生长曲线的绘制一般采用细胞计数法进行。

（1）取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。经计数后，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内（常用10mL培养瓶，也可用24孔培养板），每瓶细胞总数要求一致。加入培养液的量也要一致。细胞接种数不能过多也不能太少，太少则细胞适应期太长，太多则细胞将很快进入增殖稳定期，要求在短期内进行传代，曲线不能确切反映细胞生长情况。一般接种数量以7～10d能长满而不发生生长抑制为度。同种细胞的生长曲线先后测定要采用同一接种密度，这样才能做纵向比较；不同种的细胞也要接种细胞数相同，这样才能进行比较。

（2）酌情每天或每隔一天取出3瓶细胞进行计数，计算均值。一般每隔24h取一瓶，连续观察1～2周或到细胞总数有明显减少为止（一般需10d左右）。培养3～5d后常要给未计数的细胞换液。

（3）以培养时间为横轴，细胞数（对数）为纵轴，描绘在半对数坐标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映的数值不够精确，有20%～30%的误差，需结合其他指标进行分析。现在很多实验室利用培养板，采用MTT法来进行生长曲线的测定，较为简便。

（4）结果分析。标准的细胞生长曲线近似S形。一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏期，然后进入对数生长期。达到平台期后生长稳定，最后到达衰退期。

在生长曲线上细胞数量增加一倍的时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。细胞群体倍增时间的计算方法有两种：①作图法，在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间；②公式法，按细胞倍增时间计算细胞群体倍增时间。

四、工作注意事项

（1）若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿是否洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1h，若培养基混浊视为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。

（2）若细胞不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡崩解，漂浮在培养液中，发现这种情况应及时处理，只有生长状态良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。

五、思考题

（1）抗生素处理是目前排除细胞污染最为常用的方法，使用过程中注意的原则有哪些？

（2）绘制细胞生长曲线对于细胞培养有何意义？