人肝－的制备方法

15．3．2　人肝Mn－SOD的制备方法

Mn－SOD在纯化过程中容易破坏，其产率比纯化Cu，Zn－SOD低。它的纯化步骤常随纯化用的原料不同而有差异，如从肝脏直接提取纯化，与光分离肝线粒体后纯化酶的方法不同。从细菌及藻类中提取Mn－SOD步骤也与从动物组织中提取酶不甚一致。现以人肝中Mn－SOD纯化为例，介绍其一般的纯化方法。

（1）组织匀浆的制备。首先要使组织细胞破碎，如制肝匀浆时需取一定量肝，加入3．5倍含有0．1mmol/L EDTA的pH为7．8、0．05mol/L的磷酸钾缓冲液。在冷却条件下，用组织捣碎机制成匀浆，以14　000r/min离心30min，分离出上清液。

（2）热处理。将上清液加热到65℃，5min后置于冰盒中冷却。为了迅速加热，及时冷却，热处理应分数次进行。每次300mL上清液，以10　000r/min离心5min，分离出上清液。

（3）65%硫酸铵沉淀。加入硫酸铵，使热处理后上清液中硫酸铵的浓度达到65%饱和。在室温下搅拌60min。以12　000r/min离心10min，分离出上清液。

（4）80%硫酸铵沉淀。在65%硫酸铵沉淀后的上清液中，加入硫酸铵使其饱和度达到80%，在室温下搅拌60min，以12　000r/min离心10min，将沉淀溶于最少量的pH为7．8、5mmol/L的磷酸钾缓冲液（内含10μmol/L EDTA），然后用同样缓冲液透析，务使硫酸铵彻底除去。

（5）DE－52柱层析。将透析后的粗酶提取液通过预先用上述缓冲液平衡的DE－52柱，并用同样缓冲液洗脱。在这种情况下Mn－SOD不会被吸附，而被洗脱到收集管中。将含有Mn－SOD收集液超过滤浓缩，用pH为5．5、40mmol/L的醋酸钾缓冲液在4℃下透析16h。

（6）CM－52柱层析。将上述的透析液通过同样缓冲液平衡的CM－52柱，并用0．04～0．20mol/L的醋酸钾缓冲液（pH为5．5）进行梯度洗脱。将酶活较高的收集液混合在一起用超滤法浓缩，然后进行Biogel A柱层析。预先用含有0．1mmol/L EDTA的pH为7．5、50mmol/L磷酸钾缓冲液使层析柱平衡。上柱后用同样缓冲液洗脱。这一步骤不增加酶的比活性，但可除去微量杂质。在纯化过程中每一步骤的纯化效能见表15－15。

表15－15　人肝Mn－SOD的纯化