末端分析法

14．3．5　末端分析法

末端分析也用于酶的纯度鉴定。氨基酸末端分析分N端分析和C端分析两种。末端分析必须解决两个关键的问题：一是将氨基酸残基从肽链末端切割下来；二是将切割下来的氨基酸进行准确的鉴定，一般需要使氨基酸残基携带生色基团。SOD种类不同，其末端氨基酸残基也不同，如猪、牛、人红细胞的N端都是Ac－Ala，故是相同的，但C端猪源和人源一样，为Gln，牛源为Lys。表14－11为不同来源SOD的末端分析。

表14－11　SOD的末端氨基酸序列

续　表

14．3．5．1　N端序列分析法

图14－8　Edman降解示意图

1953年Frederick Sanger和他的同事们首次测定了牛胰岛素的氨基酸一级结构，它包含2条肽链、51个氨基酸残基。为此，他获得了1958年度诺贝尔奖。1956年，Pehr Edman引入了从N端顺序降解多肽的一种化学技术，使蛋白质结构分析有了重大进展，这就是著名的Edman降解反应（见图14－8）。所谓Edman降解就是使蛋白质N端游离的氨基与衍生化试剂异硫氰酸苯酯（PITC，phenylisothiocyanate）作用，形成环状化合物，再裂解并转化形成稳定的氨基酸衍生物，并用于定性、定量的分析，以确定其氨基酸残基的种类。余下的蛋白质片段则进入下一个循环进行降解。氨基酸分析仪的出现，使得高精度、定量地分析多肽的氨基酸组成成为可能，而基于Edman降解的自动测序仪的出现，则实现了蛋白质一级结构即氨基酸残基序列的自动测定。

在基于Edman反应的测序仪上，可有效地进行蛋白质和肽的微量测序。在一种三氟乙酸处理过的纤维膜上，加Biobrene（一种黏连剂）15μL，用氩气吹干后加载蛋白质溶液10～100pmol，再用氩气吹干，组装反应器，置于自动序列分析仪中。运行程序，将偶联试剂通过管路输送至反应器，在仪器中自动完成Edman降解的全过程。在碱性条件下，三甲胺（trimethylamine，TMA）Edman试剂PITC与蛋白质N端α－氨基酸残基偶联；在无水强酸条件下，三氟乙酸（TFA）将第一个残基从完整的多肽链上以2－苯氨基噻唑啉酮氨基酸（ATZ氨基酸）的形式裂解下来；稀酸条件下（25%TFA），ATZ－氨基酸在转化器里转化为更稳定的苯基乙内酰硫N－脲衍生物，即PTH氨基酸，生成的PTH氨基酸输送到高效液相色谱仪中进行在线分析。被切割了一个氨基酸残基的蛋白质自动转入下一个循环的降解。通常，可以将10～100pmol的样品加入到测序仪的反应器里。所需样品的量取决于样品的质量、氨基酸顺序和所要测的序列长短。降解质量也在很大程度上取决于样品的纯度、M_r、序列和测序仪的技术局限性以及化学试剂的质量。在较好的技术条件下，自动测序仪的重复收率可以达到5%以上。

图14－9　蛋白质自动测序仪反应室示意图

组装反应器（见图14－9），检漏。以下运行步骤由仪器自动完成。

蛋白质N端序列分析的具体步骤如下：

（1）偶联。以气态形式输送12%TMA水溶液，输送可完全润湿样品过滤器的5%PITC正庚烷溶液，经短暂干燥后重复输送碱。在45℃～48℃下进行反应。使用惰性气体流对试剂进行干燥。利用正庚烷和乙酸乙酯重复洗涤偶联反应产生的副产物并导入废物容器。

（2）裂解。在无水的酸性环境下（通过无水三氟乙酸实现），于45℃～48℃下反应3min，利用惰性气体流干燥以去除酸。用丁基氯溶解释放的苯胺唑啉酮氨基酸（ATZ氨基酸），并将丁基氯溶液输送入转化器。重复丁基氯抽提，收集至转化器。缺少了一个氨基酸残基的蛋白质保留在过滤器上。

（3）转化。在酸性水溶液条件下，反应10～20min，ATZ氨基酸转化为稳定的PTH氨基酸。PTH氨基酸溶解于一种合适的溶剂混合物（如20%乙腈水溶液）中，直接注入在线HPLC系统的HPLC柱上。

（4）结果分析。经空白循环和标准PTH氨基酸循环后，对18种PTH氨基酸进行校准。将每个循环切割下来的氨基酸与标准PTH氨基酸进行比较，并与前后循环的氨基酸进行比较，确定N端氨基酸序列。分析的工作可由微处理机自动完成，也可通过计算机对得到的图谱进行叠加或差减进行人工确认以确立氨基酸残基的顺序。复杂系统中制得的样品，或者表达之后的产品，也可先通过电泳分离，使用电转印的方法转至聚偏氟乙烯（polyvinylidene finoride，PVDF）膜上进行序列分析，从而确定表达产物的正确性。

14．3．5．2　C端序列分析法

在蛋白质一级结构的研究中，蛋白质C端的序列分析同样是人们感兴趣的一个领域。因为蛋白质或多肽的C端是一个重要的结构和功能单位，经研究发现有很多蛋白质的活性位点都位于C端，C端氨基酸残基的修饰、突变或降解都有可能影响到蛋白质的高级结构和生理活性。另外，对于生物技术药物而言，有必要进行结构的确证，以确保蛋白质的完整性。目前，蛋白质C端测定主要采用化学法和酶解法，已经有利用化学法进行序列测定的商品化仪器，但由于偶联试剂和裂解试剂的限制，现在用化学法一般也只能测到C端5～6个氨基酸残基。传统的酶解法是手工测定C端序列的基础，通常使用丝氨酸羧肽酶，它可以使包括二级氨基酸如脯氨酸在内的所有氨基酸从蛋白质C端解离，再通过氨基酸组成分析获得C端氨基酸残基序列。

采用L－型脯氨酸作为原料，三甲基硅烷异硫氰酸酯（trimethylsilyl isothiocyanate，TMS－ITC）作为偶联试剂制备脯氨酸乙内酰硫脲（2－thiohydantoin，TH）脯氨酸。产物经反相HPLC分离纯化后，可通过氨基酸组成分析、紫外光谱扫描、质谱或核磁共振等方法进行鉴定，反应产率高达96%。

另外一种C端分析仪是以对目的蛋白或多肽采用赖氨酸链内切酶消解，将消解产物直接送入对苯二异硫氰酸（1，4－diisothiocyanatobenzene，DITC）柱内，分馏仪将自动对其加热，将各多肽片段的N端的氨基酸残基和赖氨酸残基的氨基共价结合固定在DITC树脂上，用三氟乙酸将固定在柱上的各片段中的N端的肽链结合的氨基酸裂解，将释放的C端片段收集。采用赖氨酸链内切酶消解样品，注入柱子进行纯化，进行只针对多肽的C端肽链片段的特异性分离提取，继而采用仅具N端测序功能的全自动蛋白/多肽序列仪对多肽进行测序，实现C端测序的要求。应用这种方法，蛋白质或多肽的C端可以方便快速地被分馏，不需进一步纯化，即C端氨基酸可用目前的N端蛋白多肽序列仪进行序列分析，其特点是具有高重复性、微量样品操作、操作简单。但是，如果赖氨酸的位点较少，或者获得C端的片段很长，测到C端的序列很困难。

C端序列分析示意如图14－10所示。

图14－10　蛋白质C端衍生物示意图

进行蛋白/多肽的C端测序时，至少需要500nmol样品，而且，在C端是否存在脯氨酸或连续的丝氨酸或苏氨酸是C端测序能否成功的关键。