光化学法光化学扩增法原理

13．3．8　光化学法

13．3．8．1　光化学扩增法

（1）原理：邻联苯二茴香胺在有氧条件下与核黄素混合并经光照后，氧化呈色，在460nm处可检出，SOD可特异地增强这一氧化反应。核黄素（RF）吸收光子能量，成为激发态核黄素（RF＊）。RF＊使邻联二茴香胺（DH₂）氧化产生黄素半醌（RFH）与邻联二茴香胺自由基（DH）。按理DH与DH可反应生成DH₂与二价氧化的邻联二茴香胺（D），但由于RFH可使O₂还原为，后者可使DH还原为DH₂，从而使D不能产生。但在SOD存在下可及时被清除，故D会产生，而且在一定实验条件下，SOD浓度与D对460nm光吸收的增加量成直线相关。据此，可以测定SOD。

酶活性单位定义：以SOD蛋白含量（μg/mL）表示。

（2）测定方法：取一定量的1×10^－3mol/L邻联苯二茴香胺、5×10^－3mol/L核黄素加入到pH为7．5、0．01mol/L的磷酸钾缓冲液中，然后再加一定量SOD混合后光照8min，于460nm处比色。以SOD标准的浓度为横轴（X），以与其相对应的光氧化增强数值（ΔA）为纵轴（Y），制作标准曲线，计算直线回归方程。将样品测定值代入方程，可计算出样品中的SOD含量，或直接由标准曲线查出样品中的SOD浓度。

（3）方法特点：SOD可增强光化学反应，并可按比色常规方法处理样品与计算结果，所以该法不仅步骤简便、操作容易、不需特殊仪器，而且可以成批地测定样品中的SOD，适于临床推广使用。为使测定结果具有重复性，测定反应中试剂的用量应保持精确一致。测定体系的pH值对测定亦有明显影响，反应的最适pH值为6．0～8．0。该法的缺点是灵敏度低，因此不能用于微量分析。此外，光化学反应不仅产生，而且可能产生单线态氧。

13．3．8．2　流动注射光度法

（1）原理：核黄素（RF）受光照产生，在SOD的催化下生成H₂O₂和O₂，硫代碳酰腙类化合物双香兰素硫代碳酰腙（BMHBTZ）被H₂O₂氧化生成蓝色氧化产物，其最大吸收波长为698nm，可在分光光度计中进行检测从而测定SOD的活性。BMHBTZ与的反应机理可以表示为：

①的产生：

③BMHBTZ被氧化生成蓝色氧化产物：

（2）测定方法：超氧阴离子自由基与SOD活性流动注射测定方法：蠕动泵将H3BO₃－NaOH缓冲液、RF溶液（R1）、BMHBTZ溶液（R2）打入管路，经注射阀进入螺旋管，经高压汞灯照射5min后，BMHBTZ受氧化而产生的蓝色产物在分光光度计中得到检测。进行SOD活性测定时，SOD对照品及样品经注射阀注入。反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位，SOD活性的计算公式为：

SOD抑制率P（%）＝（A_空白－A_测定）/A_测定×100%

SOD活性（u/mL）＝P×反应液总量（mL）×样品稀释倍数/L（50%×取液量）

（3）方法特点：硫代碳酰腙类化合物具有试剂稳定、与反应灵敏、产生的蓝色产物在测定血液样品时干扰少、空白小、灵敏度、选择性高等多项优点。结合流动注射法使操作更为快速简单，便于成批样品的测定，因而成为测定和SOD活性的新方法。