变性剂和还原剂

5．7．1　变性剂和还原剂

牛红细胞Cu，Zn－SOD在含有SDS、EDTA的6mol/L尿素中加热可引起解聚，但是单独用8mol/L尿素并不能引起酶的解聚。沉降平衡分析发现，在8mol/L尿素中，牛Cu，Zn－SOD仍然只出现单一的带，相对分子质量为32　000±1　200；10mol/L尿素也不能使酶丧失活性。Bannister和Marmocci等报道8mol/L尿素可引起剑鱼肝和牛红细胞、酵母及麦胚的Cu，Zn－SOD发生解聚。但是这些结果基于凝胶排阻层析（即凝胶过滤）技术，在实验过程中作为相对分子质量标准的蛋白质本身也会发生变性，所以对是否确实引起了解聚存有不同看法。Bannister本人也对此有保留意见。有不少实验证据表明，8mol/L尿素虽然不引起蛋白质的解聚，却对酵母Cu，Zn－SOD的光谱性质有影响，从EPR图谱形状的改变说明尿素可引起蛋白质局部构象的变化。但是从总的印象看来，单单尿素并不能引起Cu，Zn－SOD发生大的改变，对牛红细胞Cu，Zn－SOD尤其是如此。该酶的远紫外区CD图谱表明，天然酶和去金属辅基的酶蛋白之间基本构象没有差别，在8mol/L尿素作用下，天然酶的CD图谱中210nm附近没有大的改变，但是酶蛋白的CD图谱却发生显著变化。从嗜热菌中提取的Mn－SOD在含有10mmol/L EDTA的8mol/L尿素中，pH中性条件下仍然很稳定，但是去除Mn后的酶蛋白就很不稳定。这些都说明金属辅基对蛋白质结构的稳定作用。SDS往往可引起Cu，Zn－SOD相对分子质量发生变化，但在1%～4%SDS的范围内，只引起酵母、细菌和麦胚Ⅰ型的Cu，Zn－SOD以及Mn－SOD发生解聚，对牛、人和麦胚Ⅱ型Cu，Zn－SOD并无影响。除去Cu，Zn的酶蛋白，在SDS作用下就容易发生解聚。Marmocci等应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳比较了牛红细胞Cu，Zn－SOD的几种衍生物形式的亚基解聚行为，发现其容易解聚的顺序为：E₂E₂－SOD＞E₂Zn₂－SOD，或E₂Co₂－SOD＞Cu，Zn－SOD，也就是说同时去除Cu和Zn的酶蛋白（E₂ E₂－SOD）比单单去除Cu的（E₂Zn₂－SOD）或用Co取代Zn的（E₂Co₂－SOD）酶蛋白更容易解聚，而后两者又比天然酶（Cu₂Zn₂－SOD）容易解聚。

还原剂和2－巯基乙醇，主要作用于—SH键或二硫键。X射线晶体结构已经探明牛红细胞Cu，Zn－SOD肽链内部的二硫键正好位于亚基相互作用的接触面上，所以二硫键的完整性对亚基缔合起着重要作用。加入2－巯基乙醇可促进人、牛和麦胚Cu，Zn－SOD的解聚。在人红细胞Cu，Zn－SOD的111位上有一个半胱氨酸（C）代替了牛酶相应位置上的丝氨酸（S），从而使酶的稳定性大大下降。用不同的提取方法或过程会发生各种转变状态的产物，而对C进行烷基化后，明显稳定了蛋白质并容易形成结晶。Fe－SOD的重组研究表明，在天然酶中有4个—SH基都包埋在酶分子内部或与Fe配位，但是当金属Fe被除去后，这4个—SH基就暴露出来，很快地与5，5′－二硫代双－2－消极苯甲酸反应，这无疑与除去金属引起的蛋白质分子构型改变有关。