生物功能研究方法

用于蛋白质分子生物功能研究的方法主要有以下几种。

（一）基因敲除技术

利用重组DNA技术将编码某种蛋白的基因从有机体基因组中敲除掉，观察缺失该蛋白的个体出现的表型变化，然后再推测蛋白在体内的可能功能。部分情况下这种敲除实验可以帮助我们了解被敲除基因编码的蛋白质分子在体内的可能功能，但是，多数情况下不能下肯定的结论。

（二）细胞转染技术

将编码某种蛋白质的目的基因（真核生物一般使用对应蛋白质的cDNA序列）插入到一DNA载体上，使之能够在待转染的细胞中表达，产生出具有活性的蛋白质分子。然后观察转染后，所产生的蛋白质对被转染细胞的行为的影响，并进而推测蛋白质在细胞内的可能功能。

（三）酵母双杂交系统

酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是一种20世纪80年代末建立起来的实验技术，是通过遗传学方法鉴定两个蛋白质分子之间在酵母细胞内是否发生特异相互作用的有效手段（图6-11）。两个蛋白质发生这种特异的相互作用的话，那么可以认为它们之间的功能可能存在某种相关性。如果相互作用的两个蛋白质分子中与一个的功能已知的话，那么就为我们认识另一个蛋白分子的生物功能提供了重要的暗示。即，该方法是利用与酵母特异启动子结合的转录因子蛋白由两个相对独立的结构域组成这一特点而设计的。通过重组DNA技术设计两个杂交蛋白：将转录因子（如GAL4）的DNA结合结构域与蛋白（X）融合，将其转录激活结构域与另一蛋白（Y）融合。然后将表达这两个杂交蛋白的载体共同转染到一个特别的酵母细胞株中。该细胞株中的GAL4基因缺失，但含有一个受GAL4转录因子激活的报告基因一般为β-半乳糖苷酶基因。如果X和Y蛋白之间能够发生特异相互作用的话，那么转染了“双杂交”蛋白的酵母细胞株中的报告基因就会被激活，而产生出β-半乳糖苷酶蛋白。否则，如果X和Y蛋白之间不能发生特异相互作用的话，GAL4蛋白的DNA结合结构域（与X蛋白融合）与转录激活结构域（与Y蛋白融合）就无法紧密联结在一起，这时的报告基因是不能被激活的。现在这种双杂交技术应用最多的是从一个用某种细胞的所有cDNA构建的蛋白表达文库中筛选出能与某一特定蛋白发生特异相互作用的蛋白。