分离计数环境中微生物的培养方法

三、分离计数环境中微生物的培养方法

1.计数微生物的培养方法

微生物数量是生态环境中微生物生物活性的重要指标，其信息有助于确认土壤的肥沃程度及金属、有毒有机物、病原体对土壤或水体的污染程度。培养计数的结果可以用于评价微生物群落的多样性或定量分析某个特定物种。然而和纯培养样品的分析不同，涉及环境中多样微生物群落的培养技术是复杂的。

不同的微生物种群、类群有不同的培养方法，计数细菌、真菌、藻类和病毒的方法是不同的，不同类群的细菌(如厌氧或自养细菌)也需要独特的培养计数方法。对于指示生物(如粪大肠菌群)或病原体(如沙门氏菌)更需要标准规范的方法。

环境样品的类型在培养计数中也是要考虑的重要因素，不同的样品要经过不同的处理后培养计数。微生物的分离培养离不开培养基，选择最适的培养基是培养计数中的最重要一环。

(1)培养计数前的处理

①土壤样品微生物的提取和稀释:土壤微生物大部分被吸附在土壤微粒上或存在于土壤团聚体的孔隙中。准确计量的前提是对微生物的有效提取。提取过程包括土粒打碎和提取液的提取，打碎方法包括存在或不存在玻璃珠的手动或机械搅拌以及超声波混合。提取液常与表面活性剂(如吐温80)和分散剂(如焦磷酸钠)一起使用。

土样提取液一般含有高数量的微生物，不适于直接进行培养计数。因此需要进一步稀释。无菌水、生理盐水、蛋白胨或磷酸盐缓冲液是稀释过程中常用的几种溶剂。尽管水很方便，也常被使用，但它不是稀释过程中的首选溶剂，因为水会对微生物产生渗透压冲击。

②水样的稀释和浓缩:不同水体中的微生物数量差异很大，有些水样需要稀释，而有的则要浓缩。稀释水样的方法与土壤提取液相似。膜过滤技术是被常用的浓缩方法，在此方法中，用真空装置使特定体积的水通过膜过滤，细菌被截留在膜上，有细菌的膜然后被放在琼脂培养基或者浸泡过培养基的纤维垫上，使其长成单个的菌落。由于不同水样微生物含量不同，因此要预估过滤水体积;此外也要注意滤膜的孔径，一般使用网眼为0.45μm的硝化纤维素滤膜。

(2)平板法

把稀释或浓缩后的样品加到已注入混合了选择性营养物的琼脂生长培养基的培养皿中，然后在一定条件培养长出可见菌落，计数每皿的菌落数即可推算出样品中的微生物数量，这就是平板法。

平板法分为涂布平板法(spread plate method)和倾注平板法(pour plate method)。涂布法是用无菌玻璃吸管把0.1ml选择好稀释度的样品稀释液均匀涂布到平板的固体琼脂上。倾注法是把1ml样品稀释液与熔化后冷却的琼脂(45℃)在培养皿中混合且凝固。涂布方法的优点在于微生物在琼脂表面生长，这样，可以根据形态较容易区分不同微生物，而且还有利于菌落分离。通常涂布法得到的菌数目比倾注法的多，这或许是因为涂布法的通气效果更好，使细菌的团块解聚。

培养平板制成后，样品在特定条件下培养，细菌繁殖形成肉眼可见，分离的菌落，这些菌落也称为菌落形成单位(colony-forming units，CFU)。由于假设每个菌落形成单位起源于一个单独的细菌细胞，所以制作培养平板之前的稀释过程把生物分开成离散的单细胞是重要的。然而，实际上菌落可能源自细菌链或细菌团，导致低估细菌数目。细菌总数是通过特定稀释出现的菌落数计算出来的。一个标准直径150mm的琼脂培养平板合适菌落范围一般为30～300。低于30，则准确率降低;高于300，准确率只是稍微偏高。事实上，培养皿中的菌落数因为拥挤及生长过程中平板上生物间的竞争而减少。

大量研究表明直接显微计数的细胞数中只有1%～10%的细胞能用平板计数技术复活成可活的细菌。首先低底物水平的环境试样中含有一些营养饥饿或寡营养生物，它们生长得很慢或根本就不可培养，所以不能在规定时间内形成菌落;其次在提取和稀释过程中施加的压迫导致活的微生物变得不可培养;再一个原因是菌落形成过程中细菌的竞争抑制了某些微生物的生长;另外，所有微生物都在营养物和电子受体需求方面有不同的最适宜及最低的生长条件，而我们的培养条件是难以满足这些条件的。

(3)最大概率数法

最大概率数法(most probable number，MPN)也可以代替标准平板法估算环境中的微生物数目。这种方法像平板计数法一样把待分析的样品分散到一种抽取溶液中，然后稀释。这种方法依赖于种群稀释到不出现待测微生物，每个稀释度接种5～10支重复的培养管，管中盛有特定的液体培养基。接种后每个管生长情况记为+或－，生长指标包括浑浊度、气体产生、基质的出现和消失。最后对给定稀释度中目标微生物的存在或缺乏的数据作统计分析，估算出环境样品中微生物数量。

最大概率数的方法论是十分有用的，我们可以按相关过程的贡献来估算微生物的数量，如亚硝化单胞菌属和硝化杆菌属细菌的硝化作用和根瘤菌细菌的固氮作用。

2．细菌培养基

(1)计数细菌的普通培养基

培养微生物的培养基必须含有支持它们生长的基质，可以利用的培养基和微生物自身一样多种多样。许多培养基已有商业生产，各种期刊、杂志也可以提供大量参考资料。微生物培养基的主要成分包括:①综合成生物量所需的碳源，如异养菌所需的葡萄糖或自氧菌所需的CO₂;②生长所需的氮，通常以铵、蛋白质、氨基酸、蛋白胨或从植物或动物体提取物来提供;③维持适当的pH值;④生长因子。

培养基也可以作为代谢指纹用于鉴定微生物。例子如API条带(API strip)和肠道菌试验管。对于环境微生物学来说，代谢指纹法系统最常见的应用就是Biolog。Biolog常用于鉴定单个的分离菌，也用来分析群落的组成。

①计数异养菌培养基:异养菌是生态环境中重要的微生物类群。应用异养平板计数法计量出的异养细菌数可以指示土壤“健康”状况，还可以指示土壤中有机营养物质的可利用性。常用的两种基本类型培养基为:富营养培养基和贫营养培养基。一般的常用培养基都是富营养培养基，如常用的营养培养基。贫营养培养基也称为最低限度培养基，其所含蛋白胨、酵母膏等成分低于75%，并用酪蛋白、葡萄糖、甘油和明胶作替代物，这种培养基的代表是RIA琼脂。在许多情况下，最低限度培养基计数可得到较高的菌落结果。

②特殊用途培养基:在计数环境样中的特定种群和确保最大可能得到这些微生物时需要有特殊用途的培养基。

预富集或复生培养基(pre-enrichment or resuscitation medium):其是能使环境样品中微生物开始活跃代谢并且数量增多的液体培养基。使用预富集培养基富集有两个目的:第一，被损坏的细胞有足够的时间和必需的营养来修复和生长。这个过程非常重要，因为一个样品直接接种到选择性的富集培养基中会导致某些细菌死亡。这一点对不能在选择条件下恢复的亚致死伤害的微生物尤为关键。第二个目的是使细胞数目增加，这对于环境样品中有少数靶生物时特别重要。

富集培养基(enrichment medium):其是一种能抑制竞争性背景区系而又加快存在于生物混合物中特定生理类型微生物生长的液体培养基。富集培养基包括择向的或选择性的。基于营养上或生理上特性的独特结合，择向富集培养基(elective enrichment medium)支持一种或有限几种细菌生长。选择性富集培养基(selective enrichment medium)同时具有支持少数选择微生物而抑制、阻止大部分微生物生长的功能。

选择性平板培养基(selective plating medium):其是一种在培养选择微生物的同时抑制或阻止另一类群微生物生长的琼脂培养基。抗生素是最广泛使用和最有效的一种选择剂。放线菌酮常用于异养培养基阻止土壤真菌生长。表15-3列举了一些最常用抗生素及其抗菌谱和作用模式。其他加到培养基作为选择剂的还有重金属(如汞、铅等)，有毒化合物等，如加入结晶紫染料能抑制大多数的革兰氏阳性菌，却允许阴性菌的生长。此外也可利用调整pH值或渗透压进行选择，有时培养条件(如温度、氧水平)也可以作为选择条件。

表15-3　　常用于选择培养基的常见抗生素

特异分离培养基(specialized isolation medium):其是含有适合特定生物种群如葡萄糖菌属的营养成分，从而可以鉴别和鉴定它们的平板培养基。

鉴别培养基(differential medium):其是含有可以区分生长在同一培养基上不同微生物成分的平板培养基。它包括一种指示剂(常为pH值)，根据不同营养需求和利用各种碳源产生的酸或碱来区分特定微生物种群。这就导致了菌落的有区别的形态特征，通常从颜色上区分。此外，它支持所选择的细菌的生长，而抑制其他细菌生长，因而培养基是选择性的，也是鉴别性的。

3.代表性细菌种群的分离计数

从理论上说，对环境样品中的所有微生物，我们都可以把它们从中分离出来，但要找到一种最便捷、最合适的方法是十分不易的，下面以一些具体例子说明如何综合利用各种处理手段和培养基达到分离培养的目的。

(1)用膜滤技术从水样中鉴别粪大肠菌群

总大肠菌群(大肠菌群)作为水污染的主要指示生物已被广泛使用，但用检测大肠菌群的方法检测到的细菌并不仅仅源于粪便。如果只计数粪便源的大肠菌群也即粪大肠菌群(fecal coliform)，则会具有更专一性的粪便污染的指示作用。膜滤技术也被用于这类菌的检测(见第十三章)。分析粪大肠菌时，将膜放到含合m-FC琼脂(Difco)的培养皿上，在45℃培养24h。粪大肠菌群生长出现蓝色菌落，非粪大肠菌的菌落是从灰色到奶油色。菌落在低倍显微镜下是可见的和可数的。检测培养基是加富乳糖培养基，其中加入1%的玫瑰酸，抑制非大肠菌群生长，提高培养温度也是选择粪大肠菌群一个关键因素。

(2)用MPN法计数污水样中沙门氏菌

沙门氏菌是一种对人类致病的肠道细菌。许多水体受到污染，因此监测这类病原体对了解其对人类的健康风险很有必要。沙门氏菌检测程序如图15-2。

图15-2　污水、污泥中沙门氏菌检测程序

在沙门氏菌的检测中充分利用了培养基的富集和选择作用。预富集过程中的蛋白胨和乳糖液体培养基对沙门氏菌复生最重要。而后面的选择分离则更多用到选择培养基。其中包括使用抑制剂硒酸钠的液体培养基、含亮绿和连四硫酸钠的mueller-hinton连四硫酸钠液体培养基(difco)。Rappaport-Vassiliadis(RV)(difco)液体培养基也广泛使用。筛选的基础是沙门氏菌对孔雀绿、MgCl₂的抗性和在pH5.0时的生长能力。而最后用于分离菌落的培养基则有选择和鉴别作用，这类培养基如hektoen肠道琼脂(difco)、亮绿胆汁琼脂(difco)或木糖-赖氨酸-脱氧胆酸盐琼脂。用于鉴别目的的特征是产生H₂S和抑制沙门氏菌发酵乳糖。选择剂包括三苯甲烷染料以及抗生素(如磺胺嘧啶)或脱氧胆酸钠盐。

(3)从土壤中分离荧光假单胞菌

假单胞菌是革兰氏阴性好氧化能异养菌，在环境中最常见。荧光假单胞菌(Flurescent pseudomonads)有黄绿色素，在生长过程通过琼脂培养基扩散并在紫外光下发出荧光。

荧光假单胞菌的分离也在称为SI的选择培养基上进行。培养基成分包括蔗糖、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、月桂酰肌氨酸钠(SLS)、甲氧苄啶、各种盐和琼脂。SLS阻止革兰氏阳性菌生长;而用氧苄啶能有效抑制兼性的革兰氏阴性菌生长;蔗糖和甘油提供选择荧光假单胞菌的渗透压;培养基上的荧光菌落用紫外光可鉴别出来。

(4)从土壤中分离亚硝酸盐氧化菌

亚硝酸盐氧化菌(或硝酸盐细菌)把亚硝酸盐氧化成硝酸盐，在硝化过程中起重要作用。这类细菌难于用平板技术直接分离，而要通过一系列的富集、分离技术，并经过最终的纯度检验才能分离出来(图15-3)。

土壤样品中亚硝酸盐氧化菌的数目也能用MPN法估算。提取之后，土壤稀释液被加到液体培养基的重复管中，培养基中含钾缓冲液、镁盐、痕量元素、铁及作为无机氧化底物的Na₂NO₂。培养3～6周检测NO₃^－的存在，以+/－记录生长，细菌数目用MPN表估算。

(5)土壤中2，4-D降解细菌的分离和计数

研究特定环境中某一环境污染物的降解菌存活或数量，对污染物的归宿及环境净化有很大的帮助，常用的方法也是常用的稀释和平板技术。用来计数和分离可降解2，4-D的细菌的培养基是选择性的鉴别富集培养基，叫做伊红美蓝(EMB)-2，4-D琼脂。该琼脂含微量盐和以2，4-D作为碳源。指示剂伊红B和美蓝可筛选革兰氏阴性细菌且因变黑而鉴别出降解2，4-D的菌落。从本质上来说，这是使用2，4-D作为选择性碳源和指示物，其既是选择剂又是鉴别剂，2，4-D降解时长出的黑色菌落是区分的基础。