蛋白质样品的准备的实验原理

实验四　BCA法测定蛋白质含量

【实验目的】

1．掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理及步骤。

2．了解BCA法的优缺点和适用范围。

【实验原理】

含有二价铜离子的硫酸铜与2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(bicinchoninic acid，BCA)组成苹果绿色的BCA工作试剂。在碱性的条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色复合物。该水溶性复合物在562 nm处显示强烈的吸光性，其吸光值和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

BCA法的优点:①准确灵敏，BCA试剂的蛋白质线性测定范围是20～200μg/ml，采用加强方法可检测到5μg/ml;MicroBCA试剂测定范围是0．5～20μg/ml。②方便快速，步骤简单，45分钟内完成测定。③经济实用，除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量。④影响因素小，不受绝大多数样品中离子型和非离子型去污剂的影响，可以兼容样品中尿素、高达5%的SDS、5%的Triton X-100、5%的Tween 20、Tween 60、Tween 80等。⑤检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法。

BCA法的缺点:①与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色方法的BCA法检测灵敏度尚不够。②实验试剂需购置商品化试剂盒，提高了实验成本。

【实验器材】

可见光分光光度计、恒温水浴锅、试管9支、移液枪等。

【药品试剂】

1．蛋白质标准液:用牛血清蛋白(BSA)，配制成1．5 mg/ml的标准蛋白质溶液。

2．BCA工作液:试剂A和B按50∶1混合。

试剂A:1%BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0．16%酒石酸钠，0．4%氢氧化钠，0．95%碳酸氢钠。混匀后调节pH值至11．25。

试剂B:4%硫酸铜。3．待测蛋白质样品。

【实验方法】

1．取9支试管，1支作空白，3支作未知样品，其余试管按表3-5中顺序，分别加入蛋白质标准液、水和试剂，即用1．5 mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0．02、0．04、0．06、0．08、0．1 ml，然后用无离子水补充到0．1 ml。最后各试管中分别加入2 ml BCA工作液，每加完一管，立即混匀(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难以消除)。未知样品的加样量见表3-5中的第7、8、9管。

2．37℃保温30分钟，，在分光光度计上测定各样品563nm处的光吸收值A₅₆₃，空白对照为第1号试管，即0．1 ml H₂O加2 ml BCA试剂。

表3-5　　　　　　　BCA法测定蛋白质含量

3．用标准蛋白质量(mg)为横坐标，用吸光值A₅₆₃为纵坐标作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A₅₆₃值，即可查出未知样品的蛋白质含量(g/L)，求未知样品的平均值。

【注意事项】

测量时不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

【思考题】

1．简述BCA法测蛋白质含量的优缺点。

2．BCA法的用途有哪些?