激光扫描共聚焦显微镜的功能及其应用

第二节　激光扫描共聚焦显微镜的功能及其应用

共聚焦显微镜的分辨率超过普通光学显微镜，染色过程简便，可以在活细胞上进行无创伤性的染色，最大限度地维持细胞的正常形态。多种自发性的荧光染料，已被广泛地用于诸如RNA、DNA、细胞核、线粒体、内质网、肌动蛋白及细胞膜等结构的标记。应用免疫荧光技术，将不同波长的2～3种荧光物质标记在内部不同结构的相应抗体上，以这几种荧光物质特定的光谱特性选择激发光和滤光片，则可以观察到细胞内部各结构间的毗邻关系。激光扫描共聚焦显微镜还可生成厚度＜0.2μm的依次相连的光学切片，即使较厚的组织的三维数据也可被计算机获取，运用适当的图像分析软件，可以测量并确定所观察结构的表面特征和体积等参数，即可用于静态观察，又可用于动态观察和测量。

一、激光扫描共聚焦显微镜的静态观察

1.单染样品的观察和分析　它可以对一种荧光标记的样品进行观察和分析，提供细胞的平均荧光强度、积分荧光强度、细胞的周长、面积和形态因子等参数，并可以直方图的方式储存起来。

2.双染样品的观察和分析　可对两种荧光标记的样品进行分析。除提供以上参数外，还可将两种参数做成散点图，但该荧光染料必须采用统一波长激光激发。对于不能用同一波长激光激发的两种荧光染料，其图像分析软件也可以将两张同一部位的不同扫描图像叠加起来，同样适用于三染甚至四染样品的观察，不过需要注意的是几种染料的发射波长必须不同，易于区分。

3.自动图像扫描观察分析　用于一个平皿中多个细胞同时观察。有时要观察的同一平皿中的细胞相距甚远，并同时需要观察其反应，通常可以将它做成一个细胞序列，然后按序列进行自动扫描分析。该功能可提供的参数同上1.和2.，但扫描分析的速度大大加快了。

4.免疫荧光的定量测定　用于高灵敏的、快速的免疫荧光测定，以准确监测抗原表达、细胞结合和杀伤及定量的形态学特征，以揭示诸如肿瘤等疾病相关抗原表达的准确定位和定量信息。包括自身免疫性疾病的多种抗原检测、AIDS机制研究、多种药物对机体免疫功能的作用、HIV复合物的监控、NK细胞结合肿瘤细胞的细胞毒实验，以及各种肿瘤组织切片的抗原表达定量分析等。

5.光谱扫描　只有光谱式扫描共聚焦显微镜具备此种功能。它可以对样品发射的荧光光谱特性在400～800nm范围内进行扫描与检测，在获取图像得同时，可获得图像中任一结构的荧光发射光谱。

二、激光扫描共聚焦显微镜的动态观察

活细胞的功能监测在细胞生物学、神经生理学、药理学等领域都有重要意义。许多荧光染料可以聚集在细胞的特定结构，而对细胞的活性基本上不产生影响。可以利用这一特性来反映细胞受到刺激后形态或功能的动态改变。

1.细胞内各种离子浓度的测定　共聚焦用于动态观察一段时间内细胞内Ca^2＋、Mg^2＋和pH等的变化，并可进行定量测定。其点扫描和线扫描可分别观察毫秒级（10^－3秒）和微秒级（10^－6秒）的快速变化。

许多参与神经元兴奋传导的离子，如K^＋、Na^＋、Ca^2＋及H^＋、Cl^－、Mg^2＋等，都有其自发性的荧光染料。Ca^2＋在细胞的兴奋、分化和死亡等过程中都起重要作用，是许多生理反应的胞内第二信使，是目前研究得最为充分的离子。通过激光扫描共聚焦显微镜对细胞内、核内钙转移的研究、对心肌细胞的钙变化研究、免疫细胞钙信号的研究及对Ca^2＋信号在凋亡细胞中作用的研究都取得了可喜的结果，而更多的研究则是将激光扫描共聚焦显微镜应用于神经生物学中对神经元Ca^2＋动态测量的研究。目前，激光扫描共聚焦显微镜以其独特的优势成为钙研究中的重要手段之一。

2.细胞膜流动性测定　对细胞膜的流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到激发光激发后，发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点、温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。

3.定量共聚焦图像分析　激光共聚焦显微镜以激光为光源并使用照明点与探测点共轭这一独特结构，从而有效抑制同一聚焦平面上非测量点的杂散荧光，且来自样品非聚焦平面荧光被抑制。基于以上两点，使共聚焦显微镜横向分辨率比普通光镜提高1.4倍，且共聚焦显微镜具有深度识别能力，使其具备纵向分辨率，可对样品进行无损伤光学切片，通过三维重组得到样品的三维立体结构。

因此借助共聚焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像；得到完整的活的细胞或组织的系列光学切片，从而得到各层的信息。三维重建以揭示亚细胞结构的空间关系，单个细胞光学切片的细胞内离子，如Ca^2＋、K^＋、Na^＋、Mg^2＋等的比率测定，并测定各种离子的动态变化；单标记或双标记生物样品的共聚焦荧光定量分析；生物样品的Z轴的强度变化；借助光学切片功能在毫不损失分辨率条件下测量样品深度的荧光分析；测定细胞光学切片的生理、生物化学特性的变化，这些特性包括DNA含量、RNA含量、蛋白质含量、分子扩散和胞内离子等。细胞内亚细胞结构的探测和分析，诸如线粒体、内质网、高尔基复合体、微管、微丝、染色体、细胞膜系统和骨架系统等，亦可对上述结构的动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位。自动的荧光图像与相差图像的重叠显示以及用于荧光测量在形态结构上的精确定位。

三、荧光光漂白后的光恢复

荧光光漂白后的光恢复（fluroscence recovery after photobleach，FRAP）技术借助高强度脉冲式激光照射样品的某一区域，从而造成该区域荧光分子的淬灭，该区域周围的非淬灭分子将以一定的速率向受照射区域扩散，而此扩散的速率可通过低强度激光扫描探测。直接控制光淬灭，进行实时测定，可直接测定分子的扩散率和恢复速率，并由此揭示细胞结构和机制，可应用于细胞骨架构成、核膜结构、大分子组装和植物细胞壁的孔径、跨膜大分子的迁移和细胞间通讯等领域的研究。

细胞间通讯的测定用于测定相邻植物或动物细胞之间的细胞通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移。动物细胞中缝隙连接介导的细胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起着重要作用，被某些癌基因和化学物质修饰的缝隙连接可能是某些癌症或肿瘤的启动信使；植物细胞中胞间连丝起到类似的作用。胞间通讯的研究为检测环境毒素和药物作用提供了一个潜在手段。更进一步的研究包括肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的细胞间通讯的抑制作用，细胞内Ca^2＋、pH、cAMP水平对缝隙连接作用的调节，植物细胞间运输的控制等。细胞间通讯的测定通过CFDA－AM标记细胞，采用荧光淬灭后的光恢复来判断胞间通讯的过程。利用激光将某些区域的荧光淬灭，这时没有淬灭的区域的荧光颗粒，就会像淬灭的区域流动，经过一定的时间以后淬灭区域的荧光有一个恢复率，以此来判断细胞间的通讯情况。

四、活性封闭和解封闭的测定

笼锁探针的瞬间光分解提供了一种在时间和空间上可控的生物活性产物或其他化合物释放的有效方法。生物活性产物或其他化合物处于笼锁（封闭，caged）状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的光瞬间照射后，光活化解笼锁（uncaged），而使其恢复原有活力和功能。可以人为的控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种在增殖、分化等生物代谢过程中发挥作用的生物活性产物和其他化合物发挥功能的时间和空间。这些生物活性产物和化合物包括第二信使、核苷酸、神经介质、Ca^2＋及某些荧光素等。

五、黏附细胞分选

对于锚定依赖性细胞，这种不改变细胞周围培养环境和细胞铺展程度及生长状态的分选方式至关重要。首先，将细胞贴壁培养在特制培养皿上，培养皿底部有一层特殊的膜，然后，总体扫描细胞群，根据荧光染色和细胞形态选定相关细胞，用高能量激光在欲选细胞四周切割成八角形几何形状，掀去培养皿底部的膜，非选择细胞则被去除。细胞的选择依赖特定的荧光及形态学分析参数决定，该筛选方式特别适用于选择数量较少的细胞，如突变细胞、转移细胞和杂交细胞，即使1%概率的细胞，筛选效果也非常理想。另一种方法，是用高能量激光杀灭不需要的细胞，留下完整的或细胞亚群继续培养，该方式也是基于细胞形态及荧光特性，此法特别适合数量相对较多的细胞选择。基于以上两种方法，可对1%概率发生的突变细胞进行筛选，不改变细胞的形态、类型、活性而克隆细胞。同时还可对分离细胞亚群进行荧光分析，自动储存细胞位置，以对特定细胞进行重复测定。已有基于膜蛋白横向运动、缝隙连接及转染特性而进行的突变细胞的筛选；分离和克隆诸如平滑肌细胞、人类畸胎瘤干细胞等转化细胞系；分离人类T细胞、黑色素细胞、肝实质细胞等细胞亚群，显示出极高的效率和准确度。

六、细胞激光显微外科和光陷阱功能

激光扫描共聚焦显微镜可将激光当作一把“光刀子”使用，完成诸如细胞膜瞬间穿孔，切除线粒体与溶酶体等细胞器，进行染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。光镊是利用激光的力学效应，将一个微米级大小的细胞或其他结构钳制于激光束的焦平面上，又称为光陷阱。光镊可以用来进行细胞融合（如卵细胞受精）、机械刺激或细胞骨架弹性测量等，特别是在测量植物细胞的细胞骨架时很有意义。借助激光共聚焦显微镜和流式细胞仪，可以更深入地研究单个活细胞的特性，分离和克隆特异细胞，进一步在肿瘤研究、细胞生物学、细胞骨架、发育生物学、胚胎学、遗传学、神经生物学、病理学和药理学等，多学科、多方面、多角度进行综合有效的研究。

七、检测荧光共振能量转移

荧光共振能量转移（FRET）是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团的发射光谱与另一个基团的激发光谱有一定的重叠。当这两个荧光基团间的距离合适时，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即用前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一种基团发射的荧光。因此，FRET现象的产生可用于证实携带不同荧光基团的两个分子靠得很近，足以产生生物学效应。荧光能量共振转移发生的条件：①有两个荧光分子存在，荧光分子1为供体，荧光分子2为接受体；②荧光分子1的发射波长正好是荧光分子2的激发波长；③荧光分子1与荧光分子2之间的距离为2～7nm。共聚焦显微镜提供了一种在细胞原位进行FRET检测的手段，利用其激光光源激发供体，多通道同时检测双重（或多重）荧光信号，并利用时间扫描程序检测荧光信号在二维及三维空间的变化，而且还可以利用其软件得出定量测定曲线和数据。

八、共聚焦显微镜可获取的图像种类

共聚焦显微镜系统采集的光学图像分为两种：荧光图像和光镜图像，其能够实现以下几个方面的光学图像采集功能：①单独采集荧光或光镜图像；②分通道同时采集多重荧光图像和投射光图像，使这些图像相互组合，同时展示在一幅画面上；③按照空间（三维）、时间或波长顺序采集图像。通过这些图像组合则可完成断层扫描、三维重建、时间动态实时监测及波长扫描等功能，从而实现空间分辨、时间分辨和波长分辨。