技术的基本原理

第二节　PCR技术的基本原理

一、PCR反应的基本原理和过程

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火和延伸3个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：加热至93℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成单链，以便引物能与之结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性、退火和延伸3个反应过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。如此循环20次，原始DNA将扩增约10⁶倍，而循环30次，将达10⁹倍，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。经扩增后的DNA产物大多为介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片段，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环不断地进行稀释至可以忽略的程度（图5－1）。

二、PCR的反应动力学

PCR的3个反应步骤反复进行，每个循环的产物均成为下个循环的底物，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝X（1＋E）ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X指起始模板核苷酸的量，E表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。E只能在很有限的循环周期中保持相对恒定，通常是20～30个循环，随后扩增效率降低，直至为0。因此，反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称为平台期。到达平台期所需的循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率及DNA聚合酶的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。在大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

图5－1　PCR反应的过程

三、PCR扩增产物

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。不同长度的PCR扩增产物是由于引物所结合的模板不同而形成的。以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，新合成的链是从引物的3′端开始延伸的，其5′端是固定的，3′端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5′端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3′端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。因此，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5′端之间，是需要扩增的特定片段。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得在大多数情况下PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。