布氏杆菌病的血清学诊断（法国

5.8　布氏杆菌病的ELISA血清学诊断（法国Institut Pourquier）

5.8.1　试验原理

1.微量滴定板上的所有微量滴定孔被布氏杆菌的脂多糖（LPS）包被。

2.待检样品被稀释并在滴定孔中温浴。在样品血清中的任何布氏杆菌特异性抗体与孔中的LPS结合，形成LPS-抗体免疫复合物，被吸附在微量滴定孔的壁上。

3.洗涤除去多余的抗体后，在微量滴定孔中加入过氧化物酶标记的抗反刍动物IgG酶标连接物，其将结合到LPS-抗体免疫复合物上。

4.再次洗涤后，在微量滴定孔中加入酶底物（TMB），所形成的蓝色复合物在反应后变为黄色，颜色的强度反应样品中抗体的比率。

每个微量滴定板必须添加阳性对照，由此判断检测效应。根据欧盟指令修改中确定的要求，这个试剂盒准许分析个体血清血浆和10个样品的血清血浆混合液。

5.使用注意事项

（1）在加试剂或检验样品时，不要把移液管放入嘴里。

（2）避免酶底物触到皮肤、黏膜和眼睛。

（3）终止液中含有硫酸，可能会引起严重的烧伤。

（4）试剂盒中的物品无感染性，但来自动物的血清应当被认为有潜在的感染性，建议检测程序完成后，使用的物品在丢弃前，至少用5%的次亚氯酸钠浸泡1小时，或经120℃高温高压处理1小时。

6.试剂盒所包括物品及其保存

建议：试剂盒中所有试剂（除了酶标记接合物和对照血清外）拿出来在室温21±5℃下预热1小时以上。

试剂盒中不包含的其他所需物品

分光光度计（酶标仪）

离心机

微量离心管

漩涡机或振荡器

能够每孔里分配300μl洗涤液的微量滴定板洗涤系统（洗板机）

精确的微量移液器及多道微量移液器（精确度应该小于或等于最小容量的10%或等于10μl，并小于或等于其他容量的5%）

各种移液器移液嘴

蒸馏水：用于处理对照血清和浓缩洗涤液的水，可以是常规蒸馏水或其他高性能纯净水。

微量滴定板覆盖物（盖子、铝箔片或覆盖物）

5.8.2　样品处理

分析个体血清或血浆时，使用者既可温浴1小时，也可温浴过夜，分析血清或血浆混合液时，只有当天温浴的样品才可使用，样品的稀释和温浴温度21℃（±5℃），在任何情况下都是一样的。用以下方法把血清（待检样和对照组）稀释成1/20。

分配：

每孔里加190μl的稀释液2

A₁孔里加10μl的阴性对照

B₁、C₁孔里加10μl的阳性对照

其他每孔里加入10μl的待检血清（每个样品只有一个微量滴定孔，A₁、B₁、C₁孔里不加待检血清）

通过细致地摇动微量滴定板，混匀微量滴定孔里的内容物

盖上盖子，在21℃（±5℃）温浴1小时±5分钟或过夜。

注意：

一是在实验室里，微量滴定板的振动器，最先是被设计用于补体结合试验微量测定法的。

二是96孔个体血清填加是个很长的过程，为了标准化血清温浴时的反应时间，对照血清和待检血清提前准备在带有96个U形孔的板子上，然后可以用多道移液器迅速的转移到微量滴定板上，在这种情况下，样品的稀释还是采用与对照组一样的稀释方法。

三是对照血清A₁、B₁、C₁的位置并不重要，它们可以在板上的任意位置。

四是对有些实验室，比如进行样品的自动化处理或为了提高重复性而提前处理样品的，试剂盒内提供的试剂量可能不够。

5.8.3　洗涤

每瓶浓缩洗涤液需要用1900毫升的蒸馏水稀释（稀释20倍），稀释后的溶液称为“洗涤液”。1瓶原液（100毫升）能全部用完的情况下，有结晶[5℃（±3℃）]也可以稀释（只需稀释部分溶液则必须等结晶全部溶解）。

用“敲打法”或其他更好的手工或自动方法把微量滴定孔中的液体排空。

每孔中加入洗涤液，再次排空。

重复两次，共洗3次。

同时处理几个微量滴定板时（为了使所有的步骤同步化），只要在一个小时之内加“洗涤液”不改变检测的有效性。

5.8.4　酶标连接物的稀释、分配

酶标连接物的稀释要依据样本温浴的模式而定。处理温浴1天、温浴1小时（个体血清和混合液）的样品时，用稀释缓冲液1把酶标连接物按1:100的比例稀释，然后每孔里加100μl的该稀释液。处理温浴过夜的样品（个体血清）用稀释缓冲液1按1:200的比例稀释酶标连接物，每孔里加入100μl的该稀释液。

盖上盖子（自带的盖子或铝箔片），在21±5℃温浴30±5分钟。

洗涤：用敲打法或其他方法排空微量滴定孔里的溶液。所有的孔里加满洗涤液，再排空。

重复步骤2次（共洗3次）。

要求：最后的洗涤对检测结果的好坏很重要，要认真操作。要是手工处理此步骤，最后一次洗涤后，把板放在吸水纸上轻拍，吸尽孔中的残留液。

5.8.5　显色

每孔里加入100μl的待用显色液。

在21±5℃温浴20分钟（避光）。

每孔里加入100μl的终止液。

轻轻地摇动微量滴定板，使显色溶液混匀，认真地轻擦微板底部。

说明：在以上方法中提到的20分钟显色时间，在我们实验室里，能提供确认标准范围内的OD值。然而不同的因素（洗涤的质量、所用水的质量、加样的准确度、反应的温度等）会轻微地改变显色效率。因为以上的因素，用此方法得到的显色结果，OD值可能会比期望值高或低，在这种情况下，此反应可在10～30分钟内终止。

在黑暗中保存微板的情况下，可在反应后1小时内读取数据。

5.8.6　读取数据

读取在450nm时的光密度（OD450），光度计必须先校正。

1.确认标准

在以下情况下，认为检测结果有效：阳性对照最小平均OD450值应是0.600。阳性对照平均OD450值和阴性对照平均OD450值的比率大于等于3。

2.结果的判断

每个样品S/P百分数的估计

3.个体血清或血浆样品

来自动物的血样，其S/P（%）≤110%时，被认为不具有任何布氏杆菌特异性抗体；S/P（%）在110%～120%之间时为可疑个体，需要做第二次检验来确定；其S/P（%）≥120%时，被认为是具有布氏杆菌特异性抗体。

血清混合液，样品S/P（%）≤20%时，被认为这组动物不具有布氏杆菌特异性抗体；样品S/P（%）＞20%时，被认为这组动物中至少有一头动物具有布氏杆菌特异性抗体。

4.注意

一是因为ELISA方法比一般常规方法更为敏感，其阳性结果不一定得到血清凝集试验、四碘四氯荧光素试验、补体结合实验的证实。

二是有些个体血清，其OD值接近阈值，可能会因温浴方法的不同而造成检测结果的差异，假使遇到这种情况，建议优先考虑1小时温浴时的结果。在过夜温浴的样品中这种情况的确存在，尤其在非典型反应出现的区域里。