内源因素所致的异质性

第三章　免疫球蛋白和抗体

学习目标

1．掌握抗体与免疫球蛋白的概念、免疫球蛋白的结构、免疫球蛋白的功能、五类免疫球蛋白的主要生物学特性。

2．熟悉多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体的概念。

3．了解免疫球蛋白的免疫原性。

抗体(antibody，Ab)是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，主要存在于血清等体液中，通过与相应抗原特异性结合，发挥体液免疫功能。早在19世纪后期，Von Behring及其同事Kitasato就发现白喉或破伤风毒素免疫动物后产生具有中和毒素作用的物质，称之为抗毒素(antitoxin)，随后引入抗体一词来泛指抗毒素类物质。1937年Tiselius和Kabat用电泳方法将血清蛋白分为白蛋白以及α1、α2、β和γ球蛋白等组分，并发现抗体活性主要存在于γ区，故相当长一段时间内，抗体又被称为γ球蛋白(丙种球蛋白)。1968年、1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会的专门委员会先后决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。免疫球蛋白可分为分泌型(secreted Ig，sIg)和膜型(membrane Ig，m Ig)。前者主要存在于血液及组织液中，具有抗体的各种功能;后者构成B细胞膜上的抗原受体。

第一节　免疫球蛋白的结构

一、免疫球蛋白的基本结构

免疫球蛋白的基本结构(即Ig单体)是四肽链对称结构。由两条相同的轻链(light chain，L链)和两条相同的重链(heavy chain，H链)通过链间二硫键连接成的整体。以IgG为例，Ig基本结构如图3－1。

图3－1　抗体的结构和分区

(一)轻链和重链

轻链(L)约由214个氨基酸残基组成，相对分子质量为25 kD。根据轻链结构与抗原性的差异，可将Ig分为κ与λ两型。同一免疫球蛋白分子上L链的型别总是相同的。正常人血清中κ∶λ≈2∶1。

重链(H)含450或550氨基酸残基，相对分子质量约55 kD或75 kD。根据重链结构和抗原性的差异，可将Ig分为五类，即IgM、IgG、IgA、IgD和IgE，它们对应的重链类别分别为μ、γ、α、δ和ε链。

(二)可变区和恒定区

1．可变区　L链近N端(氨基端)1/2处，H链近N端1/5(如IgM)或1/4处(如IgG)氨基酸的组成和排列多变，称为可变区(variable region，V区)。此区是与抗原表位发生特异性结合的部位，其中重链和轻链可变区分别以VH和VL表示。V区中与抗原表位直接接触的结构，其氨基酸的种类和排列顺序具有更大变化，称为高变区(hypervariable region，HVR)，又称为表位互补区(complementarity determining region，CDR)，V区中高变区以外的区域氨基酸的组成和排列顺序变化较小，仅对超变区的空间结构起到骨架支撑作用，称为骨架区(framework region，FR)。

2．恒定区　Ig除V区外，其余近C端(羧基端)的氨基酸残基组成和排列顺序相对稳定，称为恒定区(constant region，C区)。其中重链和轻链的恒定区分别以CH和CL表示。

在Ig的H链和L链内，均存在有通过链内二硫键折叠成的球形结构域，称为功能区(domain)。

L链功能区有两个，即VL和CL。

H链功能区较多，对于γ、α和δ重链有四个，依次以VH、CH1、CH2和CH3表示;对于μ和ε重链有五个，即VH、CH1、CH2、CH3和CH4。

免疫球蛋白通过功能区来发挥各种免疫功能:

VL和VH是抗原结合的部位，其中HVR(CDR)是与抗原表位直接作用的位点。

CL和CH上具有Ig同种异型的遗传标志。

IgG的CH2和IgM的CH3具有补体结合位点;IgG的CH2可介导IgG通过胎盘。

IgG的CH3、IgE的CH2和CH3具有结合单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B细胞、NK细胞的Fc受体的功能，由此可介导免疫细胞产生不同的免疫功能(图3－2)。

图3－2　五类免疫球蛋白的结构

(三)铰链区、J链和分泌片

Ig的铰链区(hinge region):位于CH1与CH2之间，包括H链间二硫键，此区富含脯氨酸，易伸展弯曲而改变Ig构型，从而适合与一个抗原分子表面不同距离的表位结合，或者可以结合具有相同表位的两个抗原分子，如图3－3。此外，铰链区对木瓜蛋白酶和胃蛋白酶敏感，经酶水解后，可使Ig断裂成多个片段。五类Ig中，IgG、IgA和IgD重链有铰链区，IgM和IgE重链无铰链区。

图3－3　免疫球蛋白的铰链区及其功能

J链(joining chain):是一条富含半胱氨酸的多肽链，由浆细胞合成，主要功能是将单体Ig分子连接成多聚体。IgG、IgD、IgE和血清型的IgA为单体分子，不含J链;血液中IgM是由IgM单体分子通过二硫键和J链连接组成的五聚体;分泌型IgA(secretory IgA，sIgA)为IgA二聚体，由J链连接，并与分泌片共价结合。

分泌片(secretory piece，SP):又称为分泌成分(secretory component，SC)，是一种含糖的肽链，由黏膜上皮细胞合成分泌，是分泌型IgA的一个重要组成部分。其主要生物学功能是:①通过与IgA二聚体结合，介导IgA从黏膜下转运到黏膜表面;②保护sIgA铰链区，使其不被黏膜表面蛋白酶水解。

二、免疫球蛋白的水解片段

在一定条件下，Ig分子肽键的某些部分易被蛋白酶水解为不同片段。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶是最常用的两种Ig蛋白水解酶，并借此研究Ig的结构和功能，分离和纯化特定的Ig多肽片段。

1．木瓜蛋白酶的水解片段　木瓜蛋白酶作用于IgG铰链区二硫键的近N端，从而将IgG裂解为三个片段，即2个完全相同的抗原结合片段(fragment antigen binding，Fab)和1个可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)。每一个Fab段，含有一条完整的L链和H链近N端侧的1/2。每个Fab段只能结合一个抗原表位，因此不出现凝集或沉淀现象。Fc段在低温或低离子强度下可形成结晶，故而得名。Fc段含有两条H链羧基端(C端)的一半，包含IgG的CH2和CH3。Ig在异种间免疫所具有的免疫原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、结合细胞、通过胎盘以及与SPA结合等生物学活性。

2．胃蛋白酶的水解片段　胃蛋白酶作用于IgG铰链区重链间二硫键近C端，从而将IgG裂解为一个大分子片段和若干小分子片段。大分子片段为2个Fab组成的双体，以F (ab')2表示。结合抗原为双价，与抗原结合后可出现凝集或沉淀现象。由于F(ab')2保持了结合相应抗原的生物学活性，又减少或避免了Fc段免疫原性可能引起的超敏反应，因而在生物制品中有实际应用价值。虽然F(ab')2在与抗原结合特性方面同完整的Ig分子一样，但由于缺乏Ig中的Fc部分，故不具备固定补体及结合细胞膜表面Fc受体的功能。其余若干小分子多肽，以pFc＇表示，不再具有任何生物学活性(图3－4)。

图3－4　IgG酶解片段示意图

第二节　免疫球蛋白的功能

免疫球蛋白的功能与其结构密切相关。同一免疫球蛋白的V区和C区的氨基酸组成和顺序的不同，决定了它们的功能上的差异。许多不同的免疫球蛋白在V区和C区结构变化的规律性，又使得免疫球蛋白的V区和C区在功能上有各自的共性。V区和C区的作用，构成了免疫球蛋白的生物学功能。

一、V区的功能

识别并特异性结合抗原是免疫球蛋白分子的主要功能，执行该功能的结构是免疫球蛋白V区，其中CDR在识别和结合特异性抗原中起决定性作用。免疫球蛋白分子有单体、二聚体和五聚体，因此结合抗原表位的数目也不相同。Ig结合抗原表位的个数称为抗原结合价。单体Ig可结合2个抗原表位，为双价;分泌型IgA为4价;五聚体IgM理论上为10价，但由于立体构型的空间位阻，一般只能结合5个抗原表位，故为5价。

免疫球蛋白的V区与抗原结合后，在体内可结合病原微生物及其产物，具有中和毒素、阻断病原入侵、清除病原微生物等免疫防御功能。B细胞膜表面的IgM和IgD等Ig构成B细胞的抗原识别受体，能特异性识别抗原分子，在体外可发生各种抗原抗体结合反应，有利于抗原或抗体的检测和功能的判断。

二、C区的功能

(一)激活补体

IgG1、IgG2和IgG3以及IgM与相应抗原结合后，可因构型改变而使其CH2和CH3结构内的补体结合点显露，从而通过经典途径激活补体系统，产生多种效应功能，其中IgM、IgG1和IgG3激活补体系统的能力较强，IgG2较弱。IgA、IgE和IgG4本身难于激活补体，但形成聚合物后可通过旁路途径激活补体系统。通常，IgD不能激活补体。

(二)结合Fc段受体

IgG、IgA和IgE抗体，可通过其Fc段与表面具有相应受体的细胞结合，产生不同的生物学作用。

1．调理作用　调理作用是指某些抗体(如IgG)、补体片段(如C3b)或急性期反应蛋白能够结合于病原体或颗粒物质表面，使其更容易被吞噬细胞识别捕获。

2．ADCC效应　即抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell－mediated cytotoxicity，ADCC)，是指NK细胞和巨噬细胞通过其Fc受体间接识别并杀伤被抗体包被靶细胞的过程。

3．介导I型超敏反应　IgE为亲细胞抗体，可通过其Fc段与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI结合，并使其致敏。当相同的变应原再次进入机体时，可与已固定在细胞膜上的IgE结合，刺激细胞脱颗粒，释放生物活性介质，引起Ⅰ型变态反应。

(三)通过胎盘和黏膜

在人类，IgG是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的Ig。IgG能选择性地与胎盘母体一侧的滋养层细胞结合，转移到滋养层细胞的吞饮泡内，并主动外排到胎儿血循环中。IgG的这种功能与IgG Fc片段结构有关，如切除Fc段后所剩余的Fab并不能通过胎盘。IgG通过胎盘的作用是一种重要的自然被动免疫，对于新生儿抗感染有重要作用。另外，分泌型IgA可通过呼吸道和消化道的黏膜，是黏膜局部免疫的最主要因素。

免疫球蛋白的主要生物学功能见图3－5。

图3－5　免疫球蛋白的主要生物学功能

第三节　免疫球蛋白的异质性

尽管所有的免疫球蛋白分子在结构上均由V区和C区组成，但不同抗原甚至同一抗原刺激B细胞产生的免疫球蛋白，在其特异性以及类型等诸方面均不尽相同，呈现出明显的异质性(heterogeneity)。导致免疫球蛋白异质性的因素包括内源性因素和外源性因素。

一、外源因素所致的异质性——免疫球蛋白的多样性

自然界存在的外源性抗原数目繁多，包括蛋白质、多糖、脂类等。每一种抗原分子的结构又十分复杂，含有多种不同的抗原表位。含多种不同抗原表位的抗原刺激机体免疫系统，导致免疫细胞的活化，产生多种不同特异性的抗体。理论上，每一种抗原表位可诱导产生一种特异性抗体。因此，这些抗原可刺激机体产生的抗体的总数是巨大的，包含针对各种抗原表位的许多不同抗原特异性的抗体，以及针对同一抗原表位的不同类型的抗体。多样性抗原的存在是导致免疫球蛋白异质性(即特异性)的外源因素，是免疫球蛋白异质性的物质基础。抗体的这种异质性，反映出机体对抗原精细结构的识别和应答。

二、内源因素所致的异质性——免疫球蛋白的血清型

免疫球蛋白既可与相应的抗原发生特异性的结合，其本身又可激发机体产生特异性免疫应答。其结构和功能基础是在免疫球蛋白分子中包含有多种不同的抗原表位，呈现出不同的免疫原性。Ig分子上有三类不同的抗原表位，分别为同种型、同种异型和独特型抗原表位(图3－6)。

图3－6　免疫球蛋白的血清型示意图

(一)同种型

不同种属来源的抗体分子对异种动物来说具有免疫原性，可刺激机体产生抗该异种抗体的免疫应答。这种存在于同种抗体分子中的抗原表位即为同种型，是同一种属所有个体Ig分子共有的抗原特异性标志，为种属型标志，存在于Ig的C区。

(二)同种异型(allotype)

同一种属但不同个体来源的抗体分子也具有免疫原性，也可刺激机体产生特异性免疫应答。这种存在于同种但不同个体中的免疫原性，称为同种异型，是同一种属不同个体间Ig分子所具有的不同抗原特异性标志，为个体型标志，主要存在于Ig的C区。

(三)独特型(Idiotype，Id)

即使是同一种属、同一个体来源的抗体分子，其免疫原性亦不尽相同，称为独特型，是每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志，其表位又称为独特位(idiotope)。抗体分子每一Fab段约有5～6个独特位，它们存在于V区。独特型在异种、同种异体甚至同一个体内均可刺激产生相应抗体，即抗独特型抗体(anti－idiotype antibody，AID或Ab2)。

第四节　各类免疫球蛋白的特性与功能

一、IgG

IgG于出生后3个月开始合成，3～5岁接近成人水平。IgG是血清和胞外液中含量最高的Ig，约占血清总Ig的75%～80%。人IgG有4个亚类，分别有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG半寿期约20～23天，是再次免疫应答产生的主要抗体，其亲和力高，在体内分布广泛，具有重要的免疫效应，是机体抗感染的“主力军”。IgG1、IgG3、IgG4可穿过胎盘屏障，在新生儿抗感染免疫中起重要作用。IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径活化补体，并可与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合，发挥调理作用、ADCC作用等。人IgG1、IgG2和IgG4可通过其Fc段与葡萄球菌蛋白A(SPA)结合，借此可纯化抗体，并用于免疫诊断。某些自身抗体如抗甲状腺球蛋白抗体、抗核抗体，以及引起Ⅱ、Ⅲ型超敏反应的抗体也属于IgG。

二、IgA

IgA有血清型和分泌型两型。血清型为单体，主要存在于血清中，仅占血清免疫球蛋白总量的10%～15%。分泌型IgA(secretory IgA，sIgA)为二聚体，由J链连接，含有由上皮细胞合成的SP，经上皮细胞分泌至外分泌液中。sIgA合成和分泌的部位在肠道、呼吸道、乳腺、唾液腺和泪腺，因此主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。sIgA是外分泌液中的主要抗体类别，参与黏膜局部免疫，通过与相应病原微生物(细菌、病毒等)结合，阻止病原体黏附到细胞表面，从而在局部抗感染中发挥重要作用，是机体抗感染的“边防军”。sIgA在黏膜表面也有中和毒素的作用。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染可能与IgA合成不足有关。婴儿可从母亲初乳中获得sIgA，为一重要的自然被动免疫。

三、IgM

IgM占血清免疫球蛋白总量的5%～10%，血清浓度约1 mg/mL。单体IgM以膜结合型(m IgM)表达于B细胞表面，构成B细胞抗原受体(BCR)。分泌型IgM为五聚体，是分子量最大的Ig，沉降系数为19S，称为巨球蛋白(macroglobulin)，一般不能通过血管壁，主要存在于血液中。五聚体IgM含10个Fab段，具有很强的抗原结合能力;含5个Fc段，比IgG更易激活补体。天然的血型抗体为IgM，血型不符的输血，可致严重溶血反应。IgM是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，在胚胎发育晚期的胎儿即能产生IgM，故脐带血IgM升高提示胎儿有宫内感染(如风疹病毒或巨细胞病毒等感染)。IgM也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的“先头部队”。血清中检出IgM，提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。膜表面IgM是B细胞抗原受体的主要成分。只表达m IgM是未成熟B细胞的标志。

四、IgD

正常人血清中IgD浓度很低(约30μg/mL)，仅占血清总Ig的0．2%。IgD可在个体发生的任何时间产生。五类Ig中，IgD的铰链区最长，易被蛋白酶水解，故半衰期很短(仅3天)。IgD分为两型:血清IgD的生物功能尚不清楚;膜结合型IgD(m IgD)即为BCR，是B细胞分化成熟的标志，未成熟的B细胞仅表达m IgM，成熟B细胞可同时表达m IgM和m IgD，称为初始B细胞(naive B cell);活化的B细胞或记忆B细胞其表面的m IgD逐渐消失。

五、IgE

IgE是正常人血清中含量最少的Ig，血清浓度极低，约为5×10－5 mg/mL，主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌。IgE相对分子质量为160 kD，IgE的重要特征为亲细胞抗体，其CH2和CH3结构域可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力FcεRⅠ结合，当结合再次进入机体的抗原后可引起Ⅰ型超敏反应。此外，IgE可能与机体抗寄生虫免疫有关。

第五节　人工制备抗体

抗体的上述功能使其在疾病的诊断、治疗和基础研究中发挥重要作用，因此人们对抗体的需求也随之增大。人工制备抗体是大量获得抗体的有效途径。

一、多克隆抗体

天然免疫原性物质往往具有多种不同的抗原决定簇，可刺激机体多个B细胞克隆产生多种特异性抗体，称为多克隆抗体。

传统多克隆抗体的来源是动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群。多克隆抗体的优势是:作用全面(如:中和抗原、激活补体、免疫调理和ADCC等作用)、来源广泛，制备容易。其缺点是:特异性不高、易发生交叉反应，故应用受限。

二、单克隆抗体

解决多克隆抗体特异性不高的理想方法是制备单一表位特异性的抗体。如能获得分泌仅针对单一表位抗体的细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体，就有可能获得单一表位特异性的抗体。然而，浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。为克服此缺点，K9hler和Milstein将可产生特异性抗体但短寿的B细胞与无抗原特异性但长寿的恶性骨髓瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤细胞和单克隆抗体技术(图3－7)。通过该技术融合形成的杂交细胞系即杂交瘤(hybridoma)，既有骨髓瘤细胞大量扩增和永生的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。每个杂交瘤细胞由一个B细胞融合而成，而每个B细胞克隆仅识别一种抗原表位，故经筛选和克隆化的杂交瘤细胞仅能合成及分泌抗单一抗原表位的特异性抗体，是为单克隆抗体。其优点是结构均一、纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低。

三、基因工程抗体

既保持单克隆抗体均一性、特异性强的优点，又能克服其为鼠源性的弊端，是拓展mAb人体内使用的重要思路。DNA重组技术发展，使得有可能通过基因工程技术制备基因工程抗体(genetic engineering antibody)，如人－鼠嵌合抗体(chimeric antibody)、人源化抗体(humanized antibody)、双特异性抗体(bispecific antibody)、小分子抗体及人抗体等。基因工程抗体制备的基本思路是将部分或全部人源抗体的编码基因，克隆到真核或原核表达系统中，体外表达人－鼠嵌合抗体或人源化抗体;或转基因至剔除自身抗体编码基因又敲入人Ig基因的小鼠体内，经过抗原免疫，小鼠脾脏中B细胞可产生特异性人抗体，将免疫小鼠B细胞与人骨髓瘤细胞融合，即可获得分泌特异性完全人抗体的杂交瘤，通过规模化培养获得大量特异性人抗体，已成功应用于临床上治疗肿瘤及自身免疫性疾病。

图3－7　单克隆抗体的制备

(靳　静)