卡介苗对小鼠细胞免疫功能影响的实验研究

例3　卡介苗对小鼠细胞免疫功能影响的实验研究

实验选题

卡介苗是将有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油胆汁马铃薯培养基上长期培养传代，得到的减毒菌株，可用于预防结核菌感染。由于这一疫苗最早由法国科学家Calmette和Guérin研制成功的，为了纪念发明者，将这一预防结核病的疫苗定名为“卡介苗”。目前，世界上多数国家都已将卡介苗列为计划免疫必须接种的疫苗之一。卡介苗接种的主要对象是婴幼儿，接种后可预防发生儿童结核病，特别是能防止那些严重类型的结核病，如结核性脑膜炎等。

卡介苗进入机体之后发挥作用的主要机制是细胞免疫应答，因此本实验设计的思路是想通过动物实验模拟卡介苗的接种过程，然后观察细胞免疫的各项指标，包括T淋巴细胞亚群的百分比、淋巴细胞转化率、脾淋巴细胞培养上清细胞因子检测、巨噬细胞吞噬功能检测等。一方面此实验设计可以让学生全面观察卡介苗在体内的免疫作用机制；另一方面也借此将医学微生物学和医学免疫学实验内容有机地整合在一起，以培养学生综合运用所学知识解决实际问题的能力。同时，通过实验设计，学生自主科研能力、创新意识和动手能力也得到培养。

实验设计

（1）选择动物，确定动物分组。

（2）选择卡介苗的免疫剂量、途径及时间。

（3）分离小鼠脾淋巴细胞，进行体外刺激培养，要选定刺激物的种类、剂量。

（4）确定体外刺激培养的方案；选择免疫功能检测的指标，包括免疫细胞计数、细胞因子水平检测、巨噬细胞吞噬能力的检测。

实验实施

一、卡介苗免疫小鼠脾淋巴细胞的获得、分离及T细胞亚群的检测

（1）40只小鼠，随机平分成4组。两组实验，两组对照。实验组小鼠腹部皮内接种卡介苗0．1mL（2．5mg/mL）/只，每周一次，共2次，第3周背部皮下再加强注射1次，第5周实验。

（2）取实验1组和对照1组小鼠各10只，眼球取血，分离血清备用；然后颈椎脱臼处死，取出脾脏，用生理盐水洗去残血，放入200目滤网上，用注射器针栓轻轻研磨，获得脾细胞悬液。

（3）取小试管一支，加淋巴细胞分层液2mL。将上述细胞悬液2mL沿管壁轻轻加在分层液面上，切勿混合，2500r/min离心20min。用滴管吸取脾淋巴细胞层，置一小试管中，用PBS液洗2次（2000r/min离心10min），最后一次作细胞计数并将其配成1×10⁶个/mL的脾淋巴细胞悬液。

（4）取上述脾淋巴细胞悬液涂片，分别利用抗CD4和CD8单克隆抗体，采用间接免疫荧光法检测CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群的百分比。

二、体外特异、非特异诱生小鼠细胞因子（IFN－γ、IL－2）的产生及检测

1．淋巴细胞转化及细胞因子诱生

（1）于96孔培养板上进行如下操作。

第一排每孔加入鼠脾淋巴细胞（2×10⁶个/mL）100μL，ConA 20μL（终浓度为50μg/mL），RPMI1640液80μL；

第二排每孔加入鼠脾淋巴细胞（2×10⁶个/mL）100μL，PPD 100μL（终浓度为50μg/mL）；

第三排每孔加入鼠脾淋巴细胞（2×10⁶个/mL）100μL，PPD 50μL（终浓度为25μg/mL），RPMI1640液50μL；

第四排每孔加入鼠脾淋巴细胞（2×10⁶个/mL）100μL，RPMI1640液100μL。

（2）将96孔培养板置37℃，5%CO₂孵箱孵育至72h。在培养结束前4h，每孔小心吸取上清50μL，－20℃冰箱保存备用（检测细胞因子用），然后每孔加入MTT 10μL（终浓度为0．5mg/mL），培养结束后，每孔加入100μL DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪上在490nm处测OD值，计算出淋巴细胞转化率。淋巴细胞转化结果以淋转率表示。

淋转率＝（实验孔OD值－对照孔OD值）/对照孔OD值×100%

2．细胞因子含量检测

将上述细胞培养的上清液及获得的血清，用ABC－ELISA双抗体夹心法检测其细胞因子IL－2、IFN－γ水平。

具体方法：用相应抗细胞因子单克隆抗体包被酶标反应板，依次加入标准品或样品及生物素化的抗细胞因子抗体，形成免疫复合物连接在反应板上，洗涤后再加入辣根过氧化物酶标记的生物素－亲和素复合物（ABC），洗涤后加入底物显色，加终止液后于492nm处测OD值，细胞因子浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中相应细胞因子浓度。

三、卡介苗免疫小鼠腹腔巨噬细胞的诱导和吞噬功能的检测

（1）取实验2组和对照2组小鼠各10只，于处死前三天，向小鼠腹腔注射6%的无菌淀粉液1mL，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。

（2）实验时，每只小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液1mL（置于无菌抗凝管），20min后向腹腔注入2mL Hanks液，轻揉小鼠腹部。

（3）然后将小鼠腹壁切开一个小口，吸取腹腔液0．5mL滴于载玻片上，将载玻片置于37℃温箱中孵育20min，取出载玻片迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，甲醇固定1min，瑞氏染色10min，镜检、计数。

（4）观察腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，以吞噬百分率、吞噬指数表示，计算如下。

吞噬率百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞数/200×100%

吞噬指数＝200个吞噬细胞中所吞噬的鸡红细胞总数/200

思考题

（1）卡介苗是如何影响小鼠细胞免疫功能的？

（2）分析一下PPD和ConA体外刺激卡介苗接种小鼠脾淋巴细胞的结果及意义。

（王　静）