细胞死亡的概念及其基本特征

第一节　细胞死亡的概念及其基本特征

一、细胞死亡的概念

近20多年来，随着“细胞凋亡”这一新名词的出现和研究的不断深入，在细胞死亡领域的知识得到了迅速的发展和积累。

早在1842年，Vogt在研究蟾蜍胚胎发育时发现，细胞可以一种预先设定的方式死亡。但由于当时组织学染色的方法没有采用，人们对细胞死亡的了解限于一个粗略的水平，只能从宏观上将它们称为“退化、软化、坏死以及坏疽”等，主要的根据往往是依靠它们的外在表现。曾有学者使用“坏死”这个概念描述组织的解体，也就是现在通常说的“坏疽”。可以这样理解，若“坏疽”部分不同程度地保持原有外在形态就称之为“坏死”。从不严格的角度来说，坏疽与坏死两者之间并没有太大的区别。除此之外，还有些学者提出诸如“脑软化”(brain softening)、“脂肪变性”(fatty degeneration)等概念，以适应不同的细胞死亡情况。但从总的特点来讲，它们都意味细胞死亡后细胞的核溶解、核固缩以及核碎裂，伴随着细胞结构的缺失及破坏。通过电镜，可以看到在死亡的细胞质中线粒体往往发生肿胀，形成大小不等的囊泡，线粒体嵴发生断裂直至完全消失。细胞质可以失水，细胞体积缩小;或也可能因为细胞间质中水分渗入，整个细胞反而膨大，以至于整个细胞轮廓不清。1964年，Lockshin提出了“程序性细胞死亡”(programmed cell death，PCD)的概念。它是指在生物发育过程中，细胞在特定的地点、特定的时间发生的死亡。它强调在器官发育过程中，一种生理性的、预先设定好的死亡方式。1972年，Kerr等通过结扎大鼠门静脉的一根大分支诱导肝脏萎缩，结果发现肝脏细胞通过一系列的变化零散地减少，就如同秋天时的树叶，起初他们把这种现象叫“收缩性坏死”，次年改称为“凋亡”。“凋亡”的英文原意便是来自希腊语的“树叶落下”。可惜在这以后的相当长时间里，这个具有十分重要生物意义的现象一直没有引起人们足够的重视。直至20世纪80年代以来，随着生物学、遗传学、分子生物学等的发展，人们逐步发现细胞凋亡与原来普遍意义的坏死具有很大的差别。它是一个主动的、程序化的固有过程，具有广泛而又重要的生理学意义。至此，人们对细胞死亡的理解又进入了一个广阔的新领域。

二、细胞凋亡的特征

在“细胞凋亡”一词出现之前，胚胎学家已观察到动物发育过程中存在着PCD现象。近年来，PCD和细胞凋亡常被作为同义词使用，但两者实质上是有差异的。首先，PCD是一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格控制的正常组成部分(提出这一系列观点的Sydney Brenner，H．Robert Horvitz和John E．Sulston获得了2002年度诺贝尔医学奖，图13-1);而凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死不同的受到基因控制的细胞死亡形式;其次，PCD的最终结果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序化的。

图13-1　Sydney Brenner，H．Robert Horvitz和John E．Sulston因研究细胞凋亡而获2002年度诺贝尔医学奖

细胞凋亡表现出了与细胞坏死的不同特征，主要是染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体(图13-2);②凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内容物释放，故不会引起炎症;③线粒体无变化，溶酶体活性不增加;④核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp核小体整倍数的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状。表13-1所示细胞凋亡与细胞坏死的比较。

图13-2　A、C示正常胸腺细胞;B、D示凋亡胸腺细胞(凋亡小体)

表13-1　细胞凋亡与细胞坏死的比较

三、细胞凋亡的生物学意义

细胞凋亡是生物界普遍存在的，在生物进化过程中形成的细胞死亡方式，是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是由基因控制的细胞自主的有序死亡，具有重要的生物学意义。

细胞凋亡几乎参与和影响所有胚胎的发育，不但参与清除胚胎发育过程中错位、迷途、多余的细胞，而且在动物组织器官形成及变态过程中起重要作用。两栖类动物，由蝌蚪发育为青蛙时，蝌蚪尾巴的自然消失，就是细胞自然凋亡的过程。一些动物指(趾)的形成过程也是肢端的某些细胞自然凋亡而且被吞噬消化的结果。

细胞凋亡是机体清除衰老和损伤细胞、抵御外界因素干扰、维持机体环境稳定的重要因素。研究表明在细胞DNA受到不可逆的损伤时，机体可能通过细胞凋亡来清除损伤细胞。若此时细胞凋亡受阻，则可能诱发癌症等疾病。另外，细胞凋亡还参与了许多年龄相关疾病的发病过程，如帕金森病、阿尔茨海默病等。

免疫系统是机体防御系统的重要组成部分，淋巴细胞的发育分化、成熟过程中的阳性选择(positive selection)和阴性选择(negative selection)涉及了复杂的细胞凋亡过程。在接受抗原刺激而发生的免疫反应中，参与反应的淋巴细胞和靶细胞在一定条件下均可发生凋亡，这是一种清除受病毒感染细胞和肿瘤细胞的机制。

四、判断细胞死亡的一些方法

(一)细胞死亡的判断

可以形态学的改变为指标，但更重要的依据是看其是否具有功能及繁殖能力。在培养细胞中常用的方法是看它是否还具有形成集落的能力，不能形成集落的细胞最终必然死亡。有时为迅速判断细胞是否死亡，可以用台盼蓝或中性红等染料进行活体染色。台盼蓝可将死亡细胞染成蓝色，而存活细胞则不着色，呈透明无色状;中性红染色则将活细胞染成红色，死细胞不着色。

(二)细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞死亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将两者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，以下是实验室常用的测定方法。

1．细胞凋亡的形态学检测　根据凋亡细胞固有的形态特征，可以采用许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

在光镜和倒置显微镜下，观察未经染色的细胞:凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象。细胞凋亡晚期可见凋亡小体，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。观察姬姆萨染色的细胞:凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。如果在荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜下，可采用细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有Hoechst 33342、Hoechst33258和DAPI，它们以非嵌入方式结合在DNA的A-T碱基区，紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为3期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

2．膜联蛋白(annexin)-V法检测　磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine，PS)正常位于细胞膜的内侧;但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。膜联蛋白-V是一种相对分子质量为35 000～36 000的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将膜联蛋白-V进行荧光素或生物素标记作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜;但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过受损的细胞膜而使细胞核红染。因此联合使用膜联蛋白-V与PI，可将凋亡早、晚期的细胞以及死细胞区分开来。

3．线粒体膜势能和细胞色素c的检测　线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位ΔΨm的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件。它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体ΔΨm崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的改变，可以用一些亲脂性阳离子荧光染料进行检测，实验室中常用的亲脂性阳离子荧光染料有:罗丹明(rhodamine)123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide、tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide、tetramethyl rhodaminemethylester等，它们结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

细胞色素c的定位检测:细胞色素c作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。通常它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)后启动胱冬肽酶(caspase)级联反应:细胞色素c/Apaf-1复合物激活胱冬肽酶-9，后者激活胱冬肽酶-3和其他下游胱冬肽酶。细胞色素c氧化酶亚单位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunitⅣ，COX4)是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，成为线粒体富集部分的标志。ApoAlert^TM Cell Fractionation试剂可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western印迹法用细胞色素c抗体和COX4抗体标示细胞色素c和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。

4．DNA片段化检测　细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成180～200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。采用常规方法分离、提纯细胞DNA，进行琼脂糖凝胶和EB染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱。如果细胞量很少，还可在分离、提纯DNA后，用³² P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中梯形电泳图谱的形成。

5．TUNEL法　细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的黏性3'-OH末端，可在TdT的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为TdT介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冷冻组织切片、培养细胞和从组织中分离细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

6．胱冬肽酶-3活性的检测　胱冬肽酶家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中胱冬肽酶-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。胱冬肽酶-3通常以酶原(32000)的形式存在于胞质中，在凋亡的早期阶段被激活。活化的胱冬肽酶-3由两个大亚基(相对分子质量为17000)和两个小亚基(相对分子质量为12000)组成，裂解相应的胞质胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，胱冬肽酶-3的活性明显下降。可以采用Western印迹分析前胱冬肽酶(procaspase)-3的活化，以及活化的胱冬肽酶-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶［poly(ADP-ribose) polymerase，PARP］等的裂解。也可以采用荧光分光光度计分析:活化的胱冬肽酶-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键，据此可以设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放AMC荧光强度的大小测定胱冬肽酶-3的活性，从而反映胱冬肽酶-3被活化的程度。