实验十三 动物细胞的原代培养
细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点：一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域，如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。
一、实验目的
（1）掌握无菌操作技术、倒置显微镜的使用。
（2）初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
（3）了解培养液配制方法。
二、实验原理
原代细胞培养采用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化分散为单个游离的细胞，经体外培养后，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作烦琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足2个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。
三、实验用品
（1）材料：出生后2～3d乳鼠。
（2）器材和仪器：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，高压灭菌30min备用。光学显微镜、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、记号笔、搪瓷盘、不锈钢网（100目）等。
（3）试剂：0.83%NH4Cl，胰蛋白酶（0.25%），D－Hanks液，RPMI 1640培养液，小牛血清，青、链霉素液等。
四、实验内容
（1）取材：用颈椎脱臼法处死小鼠。然后把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中消毒数秒钟，取出后放在大平皿中带入超净台置于无菌平皿中。
（2）取肾：在腰部的后缘，用解剖镊提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤，将剪开的皮肤分别拉向两侧。再换一把解剖剪及解剖镊，剪开背部的肌肉，暴露出腹腔，即可见到肾脏，用弯头眼科镊取出肾脏，置于无菌培养皿中。
（3）剪肾：用眼科剪将肾膜剪破，并将其剥向肾门，去肾膜及脂肪。用Hank液洗涤1次，将洗过的肾脏转入另一培养皿中。换一把眼科剪，沿肾脏的纵轴剪开。去掉肾盂部分，将肾剪成数块，然后用Hanks液洗涤1次。将洗过的肾块转移入无菌的青霉素瓶中。用弯头眼科剪将肾剪成1mm3大小的块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2～3次，直到液体澄清为止。
（4）消化及分散组织块：将上步清洗过的Hanks液吸掉，按组织块体积的5～6倍加入0.25%胰蛋白酶液（pH 7.6～7.8），置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20～40min。每隔10min摇动一次青霉素瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、黏稠状，并且颜色略变为白色为止。这时可从水浴中取出青霉素瓶，吸去胰蛋白酶液，此时再用Hanks液洗涤2～3次。用吸管反复吹打组织块，直到大部分组织块均分散成混淆的细胞悬液为止。此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不锈钢网）进行过滤，以去除部分较大的组织碎片。
（5）计数与稀释：从上步滤过的细胞悬液中吸取1ml细胞液，进行计数。将细胞液滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释。稀释后的浓度一般以每毫升含细胞30万～50万为宜。
（6）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般5ml/瓶，1ml青霉素瓶），盖紧瓶塞，在培养瓶上面做好标记，以免放反，并在瓶口处注明细胞、组别及日期。
然后放于培养架上，并轻轻摇动培养架，避免细胞堆积，以便细胞能均匀分布。最后将培养瓶置于37℃条件下进行培养。
（7）观察：置于37℃培养的细胞，需逐日进行观察。主要观察内容如下。
1）培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。
2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。
3）培养液变为橘红色，一般显示细胞生长良好。
经过1～2d培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作，在酒精灯旁，倒去原培养瓶中的营养液，再加入等体积新配营养液，pH 7.0。若经2～3d后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。如果希望细胞长得更好些，此时也可换液。所用的溶液称为维持液，它与营养液的组成完全相同，仅所用血清量为5%。以后每隔3～4d（视细胞液pH值而定）更换一次维持液。待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。
五、注意事项
（一）器材和液体的准备
细胞培养用的玻璃器材，如培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2h干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅，20min蒸气灭菌；MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。
（二）无菌操作中的注意事项
在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75%乙醇消毒。操作前20～30min启动超净台吹风。操作时，严禁说话及用手直接拿无菌的物品，要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。
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