小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察

时间：2022-05-12 理论教育版权反馈

【摘要】：真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。对大型动物通常采用髂骨、脊椎或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室均可进行，是研究动物细胞遗传学的好材料。低渗处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失，不能准确计数。

实验十一　小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察

真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。

小型动物的染色体制片最好的材料是骨髓组织，在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞，而不必像淋巴细胞或其他组织那样要经过体外培养。对大型动物通常采用髂骨、脊椎或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。通过骨髓得到染色体方法比较简便，一般无须无菌操作，在临床上多用于白血病的研究。在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，因此在药品检验、环境监测、食品检验等工作以及致畸、致癌、致突变等研究中，利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。

一、实验目的

（1）掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的制备方法。

（2）了解小鼠染色体的形态特征。

二、实验原理

在正常动物体内，骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，不必经体外培养，也不需要植物凝集素（phyto－hemagglutinin，PHA）的刺激，可直接观察到分裂细胞。用适量秋水仙素（colchicine）溶液注入小鼠腹腔内，可抑制分裂细胞纺锤丝的形成，使许多处于分裂的细胞停滞于中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，通过常规空气干燥法制片，便可制作出理想的小鼠骨髓细胞染色体标本。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室均可进行，是研究动物细胞遗传学的好材料。

三、实验用品

（1）材料：小鼠。

（2）器材与仪器：天平、离心机、显微镜、解剖盘、解剖剪、镊子、刀片、试管架、吸管、1ml注射器、5号针头、10ml离心管、400ml烧杯、量筒、酒精灯、冷冻载玻片、吸水纸、擦镜纸。

（3）试剂：0.1%秋水仙素溶液，2%柠檬酸钠溶，0.4%KCl低渗液，甲醇（AR），冰醋酸（AR），pH　6.8磷酸缓冲液，Giemsa染液，乙醚，香柏油。

四、实验内容

（1）秋水仙素处理：实验前3～4h按动物每克体重2～4μg的剂量，腹腔注射秋水仙素。

（2）取材：颈椎脱臼法处死小鼠，将其置于解剖盘上，从后肢膝盖上方剪开大腿皮肤和肌肉，暴露出股骨，用刀片剔掉肌肉，取出完整的股骨（从骼关节至膝关节）。

（3）收集细胞：剪去股骨的两端，用盛有0.6～1ml　2%柠檬酸钠的注射器接上5号针头，插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，至股骨变白色，取下注射器针头。反复吸打骨髓细胞，使细胞团分散，将收集的骨髓细胞移入10ml离心管中，平衡后放入离心机，1 000r/min离心8min。

（4）低渗处理：弃上清液，加入8ml　0.4%KCl低渗液，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，随即将离心管置37℃水浴中低渗10min后，1 000r/min离心8min。

（5）预固定：弃上清液，沿离心管缓慢加入新配制的Carnoy固定液5ml（加固定液时注意不要冲动细胞团块），立即用吸管吹打均匀，静置固定20min后，1 000r/min离心10min，弃上清液。

（6）固定：沿管壁慢慢加入5ml固定液，立即用吸管吹打成细胞悬液，室温下固定20min。1 000r/min离心10min，弃上清液。

（7）制备细胞悬液：视管底细胞的多少加入0.2～0.5ml新配制的固定液，用吸管将细胞团块轻轻吹打成细胞悬液。