流式细胞技术

四、流式细胞技术

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。其特点是：①测量速度快：最快可在1s之内计测数万个细胞。②可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量。③是一项综合性的高科技技术：它综合了激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术等。

（一）基本原理

流式细胞仪的工作内容主要包括有关的参数测量、样品分选及数据处理等，将待测标本制成单细胞悬液，经特异性荧光抗体染色后，进入流式细胞仪，在气体压力推动下细胞单个排列成行从喷嘴口流出，经单色激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号同时被接收，通过信号转换、处理、计算，结合多参数分析，从而实现对细胞的大小、表面性状、内部结构、抗原表达、细胞分选等理化性状的分析（图6-17）。

图6-17　流式细胞技术原理

（二）流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪的基本结构由流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统及计算机和分析系统四部分组成。

1.流动室和液流系统　流动室是仪器的核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过。流动室内充满了鞘液，将样品环形包绕。鞘液流速稳定，样品在鞘液包裹和推动下，细胞被排成单列，以每秒5 000～10 000个细胞的速度由流动室喷嘴喷出，依次通过检测区，从而得到准确的细胞荧光信息。

2.激光源和光学系统　特异荧光染色的细胞，经合适的光源照射激发出荧光供收集检测。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约22μm×66μm的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。

3.光电管和检测系统　经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光通过光电转换器转变成电信号后进行测量。在细胞以单个形式流动的情况下，经过聚焦整形的激光光束，垂直照在细胞流上，使已经荧光染色的细胞在激光束照射下，不仅产生散射光，而且发射荧光。散射光有前向散射光（0°散射）和侧向散射光（90°散射）两种，前者主要反映细胞的大小，后者主要反映细胞内颗粒物质的大小和数量。所有信号经过光电倍增管转变为电脉冲信号。

4.计算机和分析系统　经放大后的电脉冲信号被送往计算机分析器。自分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据经过处理和分析，以直方图、二维点图、三维图等方式最后给出实验结果。

除上述四个主要部分外，流式细胞仪还有细胞分选装置、电源及压缩气体等部分。

（三）技术要点

流式细胞技术的技术要点包括单细胞标本的制备、荧光染料和检测。流式细胞技术的测定对象是单细胞悬液，标本来源多样，如血液、骨髓、培养细胞、组织等，不同的标本通过不同方法制备成单细胞悬液。理想的荧光染料应具有尽可能高的荧光效率、与非特异性荧光有鲜明的对比，同时易于标记，标记后不影响本身与抗体（抗原）的生物学活性。染色方法可采用直接法、间接法和多标记法。

（四）临床应用

流式细胞术与其他细胞分析技术相比，具有快速、敏感、精密的特点，可同时进行多参数分析，分选细胞的纯度高，并能保持细胞结构和功能的完整。因此被广泛应用于免疫学、细胞生物学、生理学、分子生物学等领域，目前FCM在免疫学检验中主要用于细胞表面抗原的分析、细胞凋亡的研究、细胞分选、细胞内因子和细胞器等的研究。