核酸检测能测出甲肝吗

一、甲型肝炎病毒

甲型病毒性肝炎（viral hepatitis A）是由甲型肝炎病毒（HAV）污染的饮水、食品、用具以及手等，通过粪-口途径传播，以肝脏损伤为主的急性传染病。在发展中国家的农村和不发达国家，HAV的感染率和甲肝的发病率高，而且常常发生甲肝的暴发流行。HAV颗粒非常稳定，是直径27～32nm的20面体立体对称的圆球颗粒，无囊膜，病毒表面是由32个亚单位构成的壳粒。HAV的核酸为单股正链RNA，有感染性。HAV有空心和实心两种，空心的缺乏核酸。HAV病毒是一种具有独特性质的小核糖核酸病毒，其遗传学性质稳定，只有一个血清型，HAV有7个基因型。HAV在分子水平上的生物学机制与其他小核糖核酸病毒相距甚远。

1．样品的处理

（1）水样：采用逐步浓缩置0．1mol／L PBS（pH7．2）透析液中过夜（4℃）其间换3次PBS，蔡氏滤器（d＝0．22 nm）除菌，分装于小青瓶中（－20℃保存）。

（2）食品：采集可疑食品，粉碎，用Tris缓冲液（pH＝7．4）制成悬液，离心，收集上清进一步用CsCl做等密度超离心，产物－20℃储存备用。

（3）血液：采集病人血液，离心取血清后加入PEG-6 000至10％，NaCl至2．3％，4℃沉淀过夜，第二天10000 r／min离心10分钟，沉淀－20℃储存备用。

（4）粪便：按Linemeyer等改良法，甲肝病人粪便悬于TNE-SLS中，加玻璃珠少许，震荡均匀5 000 r／min离心10分钟，取上清，加等体积的氯仿10 000 r／min，离心取上清，加PEG-6 000至10％，NaCl至2．3％，4℃沉淀过夜，第二天10 000 r／min离心10分钟，沉淀即为较纯的HAV病毒。

（5）组织：取肝组织，研磨制成匀浆，低速离心除去废渣，用CsCl做等密度超离心。

（6）淤泥：将逐步浓缩后的样品溶液的pH调至8．0，10 000 r／min离心30分钟（4℃），取上清调至pH7．0按前述的方法透析过夜，取透析后的样品2ml，用等体积的氯仿抽提，苯酚抽提两次，等体积的异丙醇沉淀核酸（－50℃，20分钟）15 000 r／min离心15分钟，75％的乙醇洗涤一次，溶解于10ml的蒸馏水中。

2．甲肝检测技术

（1）血清学检测：抗HAV-IgM抗体是早期诊断的指标，常用于检测抗HAV-IgM抗体，方法有放射免疫法RIA和ELSIA法等，另外，抗HAV-IgG抗体双份血清的4倍增长检测可用于确诊甲肝感染。

（2）病毒培养：HAV能够在多种培养细胞中增殖，目前主要应用的细胞株有恒河猴胚肾细胞（FRHK-4）和人成纤维细胞（2139）等。HAV在培养细胞中繁殖缓慢，在适应过的细胞中培养20天左右可获得大量病毒。HAV敏感动物主要是灵长动物，如黑猩猩、绒猴、猕猴等，口服或静脉注射病毒均可感染动物，有甲肝症状的，粪便中可检出病毒。

（3）免疫电镜检测：采集甲肝病人潜伏期末和稳定期初的粪便标本制成提取液，与甲肝抗血清混合，经孵育，超离心等处理后制片，在电镜下观察。

（4）胶体金免疫层析技术（GICA）：是近年来发展起来的一种快速免疫学检测技术，用胶体金标记单克隆鼠抗人IgM抗体检测甲型肝炎特异性抗体，操作简单，特异性强，灵敏度高，结果直接可靠。

（5）核酸检测：应用RT-PCR技术，设计特异性的HAV核酸引物，可直接检测粪便和血清标本中的病毒核酸。

3．流行病学调查分型技术

（1）血清学调查：抗HAV-IgG在急性期后期和恢复期早期出现，它在体内持续存在多年甚至终身。当抗HAV-IgG滴度在恢复期比急性期升高4倍以上时，可确诊为甲肝。抗HAV-IgG可用于测定人群免疫水平，对流行病学调查具有重要意义。

（2）分型：HAV可分为7个基因型，其中Ⅰ，Ⅱ和Ⅶ型主要为人源HAV，Ⅲ型为人源或猴源HAV，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ则为猴源HAV。目前流行或散发的人源HAV中80％为Ⅰ基因型（ⅠA和ⅠB），约19％为Ⅲ型（ⅢA或ⅢB），其他型则很少。HAV基因组的VP1／2A区（翻译区）是次保守区，已被国际上公认为研究基因型的靶。HAV各基因型VP1／2A区核酸差异为15％～25％，各亚型间的差异为7．5％～15％。基因分型方法的已广泛应用于分子流行病学调查。因此基因分型方法主要依托RT-PCR和核酸序列测定比较技术，包括HAV核酸提取RNA、反转录、针对VP1／2A区的PCR、PCR产物测序、序列差异比较等步骤。