非小细胞肺癌的分子病理学

第三十六章　非小细胞肺癌的分子病理学

肺癌是大多数发达国家主要肿瘤死亡原因之一。尽管目前对其发病机制的认识有了很大提高，大多数患者的预后仍然很差。最近的年统计资料表明仅美国一年就有估计超过160　000个患者死于肺癌。我国肺癌的发病率及死亡率增长亦极其迅速，在很多省市和地区，肺癌的发病率与死亡率已居恶性肿瘤之首。目前，烟草已被证明是导致肺癌发病的主要因素。近年来，一些国家由于吸烟人数的下降，男性肺癌发病率出现下降趋势，但同期女性肺癌发病率却持续增加。研究提示除吸烟外，性别、环境与遗传等因素在肺癌发病中也起了一定作用。虽然个体的遗传背景被认为与肺癌的发病有关，但迄今为止，却很少有证据表明某种特定基因的存在可增加肿瘤易感性。

肺癌患者的预后主要取决于其疾病分期。X线、支气管镜、痰细胞学检查等常用的诊断方法对肿瘤的早期诊断意义不大。半数以上的肺癌患者到医院就诊时，已属于晚期，失去了手术切除机会。即使是最隐袭的肿瘤，其手术后5年生存率也小于60%。对于进展期或不能手术切除的患者可给予联合放疗及化疗，然而他们的生存期仅数月，5年生存率小于5%。因此，有必要寻求能够判断预示肺癌发生发展的另一些方法。

一、非小细胞肺癌组织学分型

大约70%的肺部肿瘤为非小细胞肺癌（NSCLC），根据其特征性的组织病理学改变可与小细胞肺癌（SCLC）相鉴别。W H O建议将NSCLC分为以下几种主要的亚型（表36－1）。

表36－1　NSCLC组织学分型

鳞状细胞癌（简称鳞癌）在肺癌中最常见，多见于男性，与吸烟关系密切。肿瘤主要生长于段以上支气管黏膜，倾向于管腔内生长，常早期引起支气管狭窄，导致肺不张或阻塞性肺炎，癌组织易发生坏死和形成空洞。鳞癌一般生长较慢，转移晚，手术切除机会较多，5年生存率较高，肿瘤手术切除后可再次复发，对放疗和化疗的敏感性不如小细胞癌。

腺癌多见于女性，与吸烟无密切关系。多发生于肺周边的小支气管黏液腺，腺癌倾向于管外生长，也可循肺泡壁蔓延。与鳞癌不同，这类肿瘤的发生比例正在增加。另外，它们的起病更为隐匿，由于富含血管，故局部浸润和血行转移较早，易侵犯胸壁结构，累及胸膜引起胸腔积液。

二、非小细胞肺癌体细胞突变

肺癌的早期诊断需要更为有效的手段，治疗方法的选择也应以改善肺癌患者生存为前提。这就需要对肺癌发展的分子机制，特别是对控制细胞生长、调节细胞周期及凋亡的基因的作用，以及维持细胞基因组完整性的基本原理有更进一步的了解。

肿瘤可以看作是在个体遗传素质的基础上，尤其是在个体对肿瘤的遗传易感性基础上，致癌因子引起细胞遗传物质结构或功能异常的结果。这种异常大多数不是由生殖细胞遗传得来，而是在体细胞中新发生的基因突变所致。迄今分子生物学研究表明，肺癌的发生发展是一个由多基因参与的多步骤、多阶段的复杂过程，在这些基因的变化中最常发生的两类基因的异常变化是：原癌基因（proto－oncogenes）及肿瘤抑制基因（tumour－suppressor gene，TSG）的变化。原癌基因是正常的细胞同种显性等位癌基因，常参与信号转导及转录，调控细胞生长和分化。原癌基因在个体发育或细胞分裂的一定阶段十分重要，但在成体或平时却不表达或表达受到严格的控制，当其发生点突变、扩增、易位或重排等改变时，产生的癌蛋白在性质或数量上异于正常，就可能导致细胞发生恶性转化。原癌基因以显性方式起作用，癌基因的一个等位基因发生突变即可引起恶性转化。相反，肿瘤抑制基因要求在两个等位基因都发生突变和（或）缺失时，即处于纯合失活状态时，细胞才会因正常抑制的解除而恶性转化。这些基因的功能是抑制细胞的生长和促进细胞的分化，从而抑制肿瘤的发生过程。

到目前为止，已发现了多个与非小细胞肺癌发生相关的原癌基因及肿瘤抑制基因，这些基因的发现和深入研究，提高了对肺癌的发生、发展规律及对细胞增殖与分化的调控机制及其浸润转移机制的认识。肿瘤的发生与转移与某些特定的癌基因密切相关，对这些癌基因及其产物的检测，为肿瘤的临床诊断提供了一条崭新的途径。但分析体细胞突变与临床相关性时，应看到各种体细胞突变不仅取决于被检查癌的类型、分期以及与它的发展相关的环境因素，而且也取决于发现这些异常所使用的检测手段和技术条件。另外，个体的遗传全貌、宿主的免疫反应以及伴随的遗传改变的存在均对所观察到的细胞功能障碍的程度有影响。

三、癌基因以及原癌基因

（一）ras家族

原癌基因的ras家族由分别定位于第11，12，1号染色体上的H－ras，K－ras，N－ras组成。编码产物为分子量为21×10³的膜结合蛋白（p21Ras），位于细胞膜的内侧面，对二磷酸鸟苷（GDP）和三磷酸鸟苷（GTP）具有高度亲和力，并具有同源性GTP酶的活性。目前认为Ras蛋白有活化和非活化两种形式，通常情况下，细胞内的Ras蛋白处于非活化状态，具有能够与GDP相结合的构象，当受到信号传递通道上游某一外界因子的刺激时，便使GDP变成GTP，随后Ras蛋白发生构象改变，转为活化状态，可与效应分子相互作用，实现生长信号的传递并在Ras蛋白自身的GTP酶作用下，催化GTP水解，转变为与GDP结合的非活化形式。p21Ras蛋白通过与GDP和GTP结合并水解GTP完成其对正常细胞生长信号的传递和调节功能。ras基因活化的主要方式包括编码区内的突变及基因过度表达。ras基因的突变可扰乱正常状态下活化与非活化Ras蛋白的这种平衡机制。现已知道第12，13或第61位密码子的点突变特别是G－T易位可激活ras基因，从而导致其编码的蛋白p21Ras的G TP酶活性明显下降，使Ras蛋白维持于活化状态，不断激活靶分子，引起信号传导的持续效应，导致细胞过度增殖，最终发生癌变。

在自然发生的人类肿瘤中，ras基因的突变激活主要为K－ras和N－ras。而对肺癌的研究表明，非小细胞肺癌中以K－ras突变为主。各种研究报道的肺癌K－ras突变频率有很大的差别，从15%至60%不等。进一步分析发现K－ras突变主要存在于腺癌，约30%的原发肺腺癌显示这种突变，而大多数这种突变已经在第12位密码子检测到。其他类型的非小细胞肺癌K－ras突变频率一般不超过10%，少数研究报道，采用敏感方法检测鳞癌中突变频率可达到15%。肺癌患者k－ras突变与性别的关系尚存争议，有报道K－ras突变多见于女性。现已知道烟草中的致癌物（如苯并芘）可诱导K－ras原癌基因的突变，多个研究表明腺癌的K－ras突变与吸烟有关，但吸烟的烟龄及吸烟量却与K－ras突变无相关性。由于腺癌与吸烟的关系并不密切，且仅20%的吸烟者发展为肺癌，因此肺癌的发生除吸烟外，一定有另外的作用因素。当然，吸烟的腺癌患者中更容易有ras癌基因的突变。

K－ras突变与生存期的相关性在腺癌的早期更为普遍并且与治疗方式无关，统计学分析表明，肿瘤表达K－ras突变的患者比无突变者生存时间缩短，但此仅限于部分期别的肺癌患者。另有认为肺腺癌中K－ras的激活与转移相关。然而，这一发现还没有在以后的研究中被证实，一些研究显示K－ras突变与肿瘤转移或分期并不相关。一个有趣的临床发现是K－ras突变与NSCLC进展分期的关系。NSCLC的研究表明K－ras在肺癌早期起作用。例如，肺泡的不典型增生——肺腺癌可能的前体细胞中可检测到K－ras表达。肿瘤周围的正常肺组织中也观察到高比例的K－ras突变，提示可能在癌肿发生的最早期阶段参与作用。但K－ras突变是否能作为肿瘤发展的标志物尚需进一步研究。

（二）myc基因

细胞原癌基因的myc家族包括c－myc、N－myc和L－myc。这些基因编码细胞周期特异性核磷酸蛋白，参与调节其他基因对细胞增殖的控制作用。因此，它们参与细胞生长及分化，而且有可能在细胞凋亡中起了特别的作用。当机体发生肿瘤时，myc基因家族成员可以发生染色体基因易位、基因扩增以致表达过度。这些基因的细胞表达改变首先被发现多见于小细胞肺癌。然而，多个研究表明NSCLC中亦存在c－myc以及L－myc的表达异常，c－myc过度表达的患者生存期短于没有过度表达者并且转移的概率增加。但myc基因的异常表达能否作为预测患者预后的标记尚有待于进一步研究阐明。

（三）c－erbB－2基因

c－erbB－2原癌基因又称为HER2/neu，是一种编码显示酪氨酸激酶活性跨膜受体蛋白（p185neu）的原癌基因。该基因与编码表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的癌基因以及病毒癌基因v－erbB有很高的同源性，其编码产物分子量为185×10³，与erbB1（EGFR），erbB3及erbB4一起同属于erbB受体家族。通过与表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）以及转化生长因子－α（transforming growth factor alpha，TGFα）等一系列配体结合形成二聚体，这些蛋白可刺激表皮细胞的增殖，在细胞信号转导中起了重要作用。但一些研究报道erbB2诱导的肺上皮细胞恶变需要EGFR的功能作用，c－erbB－2的过度表达在肺癌发生中很可能是与erbB1，erbB3协同作用，而不直接参与肺癌的发生。

c－erbB－2的激活包括基因扩增和（或）基因的过度表达，该基因扩增和受体的过度表达与许多肿瘤恶性行为及预后差相关。研究发现18%～53%的非小细胞肺癌中存在有c－erbB－2的过度表达，其中尤以腺癌表达比例较高，检测率与所用技术相关。一些研究显示p185neu的过度表达与生存期缩短有关，c－erbB－2mRNA水平与EGFR一起可预示NSCLC患者预后不良，但这一结果没有在所有的研究中得到证实。最近一项Meta分析表明c－erbB－2表达阴性的患者较表达阳性者有较好的生存期，c－erbB－2可能是预示非小细胞肺癌预后不良的一个因子，但由于该分析可能存在偏倚，因此尚有待于进一步研究。

核苷酸的切除修复（nucleotide excision repair，NER）被认为是顺铂等药物引起DNA损伤时的主要修复机制。有报道c－erbB－2的过度表达可影响某些人类肿瘤细胞对顺铂等化疗药物的敏感性，推测其可能通过干预NER而修饰DNA修复活性。HER2/neu的过度表达与DNA修复及肿瘤细胞内源性的化疗药物耐药有关。体外研究表明HER2/neu过度表达的NSCLC细胞有更强的NER活性，从而导致顺铂细胞毒性作用的减弱。这种受体表达的测定可能可作为确定临床化疗药物反应的一种方法。

（四）bcl－2基因

bcl－2是一种编码抑制细胞程序性死亡的蛋白的癌基因，因此，这种基因的过度表达导致细胞生存时间的延长。在肺癌中，bcl－2基因在抑制肺癌细胞程序化死亡中的作用机制仍不清楚。据报道，46%的Ⅰ期NSCLC中存在bcl－2的表达，其中尤以鳞状细胞癌中表达更为常见。大多数研究认为bcl－2在肺癌的发生中起重要的促进作用，但其与NSCLC的细胞学类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期等的关系尚未形成统一认识。有人报道，bcl－2过度表达在肺癌发生的早期出现。随着肿瘤的发展，一旦细胞获得恶性表型，bcl－2就不再起主要作用或失去作用。

尽管多个研究表明NSCLC表达bcl－2比不表达者有较好的预后结果，bcl－2对NSCLC患者的预后价值尚存争议。在ⅢA至Ⅳ期NSCLC研究中，未显示bcl－2可作为独立的预后因子。bcl－2是否是另一些有利的遗传异常的标志以及它是否在预防肿瘤进展中起了积极的作用尚需进一步确定。

（五）其他癌基因

NSCLC的组织病理学检查发现有许多种其他癌基因的参与，包括c－fos以及c－jun，它们被分类为即刻早期转录因子。这些因子被促细胞分裂刺激素强烈诱导，随后结合形成被称为AP－1的异源二聚体复合物。AP－1复合物接着与DN A结合并激活DN A转录。这些癌基因对细胞进入细胞周期的有丝分裂期是重要的，这样一来，它们的不受控制的活动促进了细胞的过度增殖。NSCLC中c－fos以及c－jun表达增加和减少均有报道。鳞状细胞癌如果表达c－fos以及c－jun蛋白，患者趋向于较差的预后。然而，Levin等研究表明与邻近的正常组织相比，NSCLC中c－fos以及c－jun表达显著降低。显然地，需要进一步研究以确定这些转录因子在肺癌病因学中的作用。

四、肿瘤抑制基因

（一）p53基因

p53基因是一种肿瘤抑制基因（tumour－suppressor genes，TSG），基因表达产物为P53蛋白，参与细胞周期调节，并维持基因组完整性。在正常细胞中，P53的核表达非常低。然而，一旦射线或其他因素引起DN A损伤时，其表达就大量增加，与特定的DN A序列结合，诱导野生型p53活化片段－1（wild type p53－activated fragment，WA F－1）基因产物P21蛋白的生成，而P21蛋白则与肿瘤增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCN A）结合，从而抑制DN A复制；P21蛋白同时还抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）的底物磷酸化，阻止细胞周期从G1到S期。这可防止正在增殖的细胞通过随后的细胞分裂引起基因组的损伤。如果DN A的损伤非常强烈以至于不能修复，则p53表达指导细胞发生凋亡。人类各种癌症中，60%左右存在p53基因突变。缺乏p53的肿瘤细胞不能凋亡，维持了肿瘤细胞的生存，也增加了对化疗药物和放射治疗的耐药性和抵抗性。p53基因的失活在大多数情况下是通过一个等位基因的缺失以及另一等位基因的突变而发生。p53基因中观察到的最常见的异常是错义突变导致的单个氨基酸的改变，通常发生在外显子5～8。这可导致细胞核中突变型P53蛋白的过度表达。其他类型的p53突变，如缺失以及剪接突变，不会导致P53蛋白免疫活性的聚集。因此，用免疫细胞化学方法检查P53蛋白过度表达的研究有可能过低估计p53突变的真实程度。另外，P53蛋白表达的增加可能仅代表发生在肿瘤细胞中高水平自发基因组错误的正常反应。除p53基因失活外，现在有证据表明P53蛋白的一些突变可引起功能改变。在这种方式下，它可发挥癌基因的功能，可能连接并阻止正常野生型P53蛋白活动。

P53表达的改变是癌最常见的遗传异常。30%～60%的NSCLC中发生P53表达的异常，发生频率与肿瘤类型有关。大约50%的鳞癌以及大细胞癌有P53的过度表达，而腺癌中仅30%～35%。P53的过度表达还与肿瘤高恶性度，淋巴结转移以及生存期缩短有关。在还没有淋巴结转移的NSCLC中，P53的过度表达与生存时间缩短相关。相反，淋巴结阳性的肿瘤中与生存时间长短无关。与P53表达相关的生存时间减少在Ⅰ期和Ⅱ期腺癌和鳞状细胞癌中也可见到。这些研究表明肿瘤中P53的改变可能增加转移的可能。P53表达调节失常的肿瘤细胞基因组不稳定性的增加，可能导致二次突变的可能性增加，从而导致转移。确实，超过1/3的P53阴性的Ⅱ期NSCLC患者转移淋巴结P53阳性。P53阳性的淋巴结的存在特别提示预后不良。但在一组94名原发切除肿瘤中未发现生存与P53表达的这种关系。

P53过度表达与吸烟有关。像K－ras一样，因吸烟引起的p53的点突变通常包含G－T或G－A的易位，而且与一生中吸烟总量有关。腺癌中p53突变的低发生与这种类型肿瘤与吸烟相关性差有关。P53的过度表达存在于当前吸烟或曾经吸烟的腺癌患者，并且更常见于分化差的肿瘤。

18%的NSCLC中可检出抗P53抗体。P53自身抗体的存在与肿瘤进展及期别有关，但与患者生存期无关。

支气管的癌前病变（组织化生及发育不良）以及原位癌也可见到P53的表达。这提示P53异常可能是肿瘤发生中的早期事件，而且可能早于肿瘤侵袭之前发生。如果该结论被证实的话，检查异常P53的存在可能是一个有用的预防策略。

（二）FHIT基因

脆性组氨酸三连体（fragile histidine triad，FHIT）基因是定位于染色体3p14.2的肿瘤抑制基因。该基因产物是分子量为17×10³的多肽，具有二核苷酸多磷酸水解酶活性，而没有FHIT的活性，被认为可刺激DNA的合成。包括肺癌在内的各种肿瘤中均报道有FHIT基因的异常转录。最近的研究表明73%的NSCLC缺乏FHIT基因的蛋白产物（PFHIT），在癌前病变中缺失率为93%。PFHIT缺失特别与鳞状细胞癌相关，吸烟者肺中是不吸烟者的2倍。这表明FHIT基因在控制支气管细胞增殖中起了重要作用，可能是癌变早期识别的重要靶点。然而，肿瘤细胞中的观察不支持PFHIT有典型的肿瘤抑制作用。特别是它的过度表达不改变细胞周期动力学，也不抑制细胞的增殖或克隆形成。另外，当测定FHIT基因的基因组序列时所观察到异常主要是剪接及转录处理异常。这些结果表明PFHIT缺失可能是细胞功能改变的标志，值得未来进一步研究。

（三）Rb基因

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）基因是最早发现的肿瘤抑制基因，定位于染色体13q14.11，编码分子量为110×10³的核磷酸蛋白（Rb蛋白），参与细胞增殖及分化。与SCLC中几乎普遍存在Rb异常不同，NSCLC通常无Rb蛋白功能或表达的改变。的确，第1个关于NSCLC中Rb蛋白表达的报道研究发现大部分这些肿瘤表现为正常的表达，Rb蛋白的缺失与疾病进展的期别有关。对ⅢA及Ⅳ期的NSCLC研究发现60%的肿瘤Rb蛋白表达检测阴性。肿瘤表达Rb蛋白的患者较不表达者表现为更长的中位生存期。Rb表达的这种有利影响在当其他肿瘤抑制基因以及癌基因（如ras，p53等）存在异常时特别显著。尽管如此，Rb表达作为NSCLC的预后因子的价值尚存争议。

（四）CDKN2

染色体9p21区位编码许多基因，其蛋白产物有肿瘤抑制作用，特别是在选择性剪接时。CDKN2部位表达α以及β转录子。这些α以及β蛋白产物分别是P16^INK4A（P16）和P19ARF（P15）。它们是细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂，在细胞周期调节中起重要作用。在细胞核中，P16抑制Rb蛋白的细胞周期蛋白D－依赖磷酸化作用，使其保持活性结构，细胞生长阻滞于G1期。P16表达的下调允许Rb蛋白磷酸化作用，因此，细胞进入生长周期的S期。这种P16－Rb的相互作用是重要的细胞分裂控制点，必须通过才能保证细胞生长。

在过去的几年中，有许多报道证明在45%～75%的NSCLC中P16蛋白表达减少，蛋白表达缺失的主要机制包括纯合子缺失，因甲基化作用引起的转录沉默以及移码/错义突变。P16表达的缺失主要见于鳞状细胞癌，与淋巴结转移以及临床分期有关。肿瘤表达P16蛋白的个体较不表达者显示较长的生存期，这在早期阶段特别明显。

另一些研究尝试替换有缺陷的p16基因以确定细胞是否能回复正常的生长特性。研究发现在不表达P16蛋白的肺癌细胞中插入野生型p16基因导致细胞生长及克隆形成的抑制。P16的作用与抑制Rb磷酸化，从而使细胞周期阻滞于G1期有关。

虽然很少研究测定NSCLC中P19ARF蛋白的表达，但Vonlanthen及其同事研究发现50%的肿瘤中很少或没有P19ARF蛋白的表达。这一领域值得进一步的研究。

在NSCLC中，CDK N2的近端区域经常发生纯合子缺失，提示在染色体9p上存在其他的肿瘤抑制基因。这些基因在细胞周期调节及NSCLC发病机制中的潜在作用尚有待于进一步观察。

（五）其他肿瘤抑制基因

结肠癌（MCC）及结肠腺瘤性息肉病（A PC）中突变的是两种与结肠癌发病机制相类似的肿瘤抑制基因。这些基因紧密连接在染色体5的长臂（5q21），据报道在20%的切除NSCLC中存在缺失。这些基因的表达异常更多报道于鳞状细胞癌，它们的缺失与纵隔淋巴结累及有关。

3p的半合子缺失是NSCLC中常见的发现，约50%的肿瘤显示有异常。据推测3p的缺失导致了新的肿瘤抑制基因的缺失，代表肿瘤发生中早期重要事件。尽管鳞状细胞癌与腺癌中均观察到3p的缺失，但仅在后者中3p的缺失与生存缩短相关。3p的缺失在3p12，3p14，3p21以及3p25附近。临近该染色体的潜在的肿瘤抑制基因及癌基因包括von Hippel－Lindau肿瘤基因，β^－维甲酸受体基因以及R A F癌基因。

42%～56%的进展期NSCLC中可见到影响染色体17q，18q和11q23的杂合现象缺失，此表明这些位置的新的肿瘤抑制基因参与肺癌的发生及进展。

尽管未检测到N M23－H1基因的突变，其蛋白表达在NSCLC中较正常肺组织多见。鳞状细胞癌中N M23－H1（N M23－H1－二磷酸核苷激酶A）蛋白的高水平表达与肿瘤分期显著相关，而且它的存在与细胞增殖有关。在肿瘤早期阶段，N M23－H1蛋白的存在与组织学分化差有关，它的表达与无疾病生存呈负相关。在一些类型的肿瘤中，N M23－H1蛋白被认为是转移抑制基因。Ⅰ期NSCLC中高蛋白水平表达与无转移有关。

五、微卫星不稳定性

微卫星序列是在基因组中分散分布的相当短的串联重复（tandem repeats）。这些微卫星序列的缺失或增加反映了错配修复基因如h MSH2及h PMS1的异常。2%～34%的NSCLC中报道有微卫星不稳定性（microsatellite instabilities）。

六、端粒末端转移酶

端粒是真核细胞染色体末端的一个特殊结构，由一段具有特定重复序列的DNA和端粒结合蛋白组成，是维持染色体结构稳定的重要因素。端粒末端转移酶（telomerases）是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，对端粒的复制和结构的维持具有重要作用，由于端粒的缺失可能代表固有的生物学老化机制，一般而言，癌细胞表达高水平的端粒末端转移酶是值得注意的。这可能会促成这些细胞生长控制的缺乏。研究发现，大约80%以上的NSCLC有高水平的端粒酶表达，端粒酶的阳性表达不仅与肿瘤的良恶性有关，而且可能与肿瘤分化（分化越差表达越强）、复发和转移有关，因而许多学者认为端粒酶活性可以作为恶性肿瘤的标志和预测预后的指标并可能作为肺癌治疗新的靶点。但有趣的是，一些转移肿瘤并不表达高水平的端粒末端转移酶活性。而一些研究结果也表明，除端粒酶活性外在肿瘤和永生化细胞中还存在其他机制或旁路来维持端粒的长度。

七、小结

NSCLC是由多种原因引起的疾病，与基因组完整性及多种基因表达特别是原癌基因以及肿瘤抑制基因异常有关，其中K－ras癌基因的表达特别与NSCLC相关。鉴定基因表达的重要改变对指导化疗药物设计及靶向定位具有非常重要的意义。

（洪群英）

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