实验34 生物素-亲和素技术
(Biotin-Avidin Technology)
【目的】
了解生物素-亲和素技术的基本原理、常用方法及主要用途。
【原理】
生物素-亲和素系统(biotin avidin system，BAS)是利用生物素与亲和素之间有高度亲和力及多级放大效应，并与免疫标记技术相结合的原理，由此使各种示踪免疫分析及特异性和灵敏度进一步提高。
生物素在机体内以辅酶形式参与各种羟化酶化反应，故称为辅酶A或vitH，分子式为C10H16O3N2S，有两个环状结构，其中半唑酮环(vreido)是与亲和素结合的主要部位;噻吩环的C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。利用生物素的羧基的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(PBNP)，其中以BNHS最为常用。
亲和素亦称抗生物素蛋白或卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kU，在pH9～13的溶液中保持稳定，特别是与生物素结合十分稳定，但对强光合Fe比较敏感。亲和素由4个亚基组成，能结合4个分子的生物素。
BAS放大系统检测技术主要有以下三种类型: BAB法(biotin-avidin bind，BAB)或BRAN(bridged avidin-biotin); ABC法(avidin-biotin-peroxidase complex method); LAB法(labelled avidin-biotin technique)
一、BAB法(桥亲和素-生物素技术)
利用亲和素与生物素结合的多价性，以游离的亲和素作为桥臂居中，将分别结合有抗体辣根过氧化物酶的生物素与之连接在一起，从而达到检测抗原的目的。首先将生物素化抗体与样品中相应抗原结合，再以游离的亲和素与生物素化的抗体结合，然后加入酶标生物素，最后通过过氧化物酶的显色反应来标定样品中的抗原成分。这种以亲和素为桥臂的复合物结构系统十分稳定而灵敏，形成多级放大体系，使检测灵敏度大为提高。
【材料】
1.生物素标记的抗体(抗-抗动物种属的抗体)。
2.酶标生物素。
3.亲和素。
4. 96孔酶标板。
5. PBS 0.01mol/L pH 7.2。
6.包被液: 0.06mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液。
7.底物:邻苯二胺、双氧水。
8.终止液: 2mol/L H2SO4。
9.酶标仪: 495nm的滤光片。
【方法】
1.将抗原0.2～2μg/ml，用包被液稀释后按100μl/孔加入到96孔酶标板中37℃2h。
2. PBS洗3次。
3.加1％BSA作用30～60min。
4. PBS洗3次后加生物素标记抗体，37℃30min。
5. PBS洗后加亲和素，37℃30min。
6. PBS洗后加酶标记生物素37℃30min。
7. PBS洗后加100μl底物避光显色15min。
8. 50μl 2mol/L H2SO4终止反应。
【结果】
酶标仪上测OD值(495nm)。
二、ABC法(亲和素-生物素-过氧化物酶技术)
先用抗原(人免疫球蛋白)包被，加兔抗人Ig与之结合后，加生物素化羊抗兔Ig(第二抗体)，再加亲和素-生物素化酶复合物与底物显色而检测。
【材料】
1.包被缓冲液:碳酸缓冲液(pH9.5，0.05mol/L)。
2. 96孔酶标板。
3.包被用抗原(人免疫球蛋白) Hig。
4.待测抗体:兔抗人免疫球蛋白血清(RAH Ig)。
5.对照血清:正常兔血清(NRS)。
6. PBS Tween，含0.5％T20的PBS(pH7.2，0.01mol/L)。
7.生物素化羊抗兔免疫球蛋白与酶标羊抗兔免疫球蛋白。
8.亲和素-生物素化酶复合物(ABC)，亲和素1∶75(用ABC稀释剂稀释)，生物素化酶(b-HRP) 1∶100，ABC稀释剂2号，AV和b-HRP以等体积混合30min后成ABC。
9.底物缓冲液:柠檬酸盐缓冲液pH5.0，0.1mol/L。
10.底物: OPD-H2O2，邻苯二胺0.5mg/ml中加H2O2(3％) 15μl。
11.终止液: 2mol/L H2SO4。
12. 96孔酶标板。
13.酶标仪。
【方法】
1. 96孔板内加H Ig(1μg/ml)每孔0.1ml，置4℃18h。
2. PBS洗3次，加RAH Ig/NRS(1∶1000～1∶1024000)，每孔0.1ml，置37℃1h。
3. PBS洗3次加SAR Gb(1∶10000)，每孔0.1ml，置37℃1h。
4. PBS洗3次加ABC，每孔0.1ml，置22℃30min。
5. PBS洗3次加底物，每孔0.1ml，置37℃10min后，加2mol/L H2SO40.1ml终止反应。
【结果】
酶标仪上测A值(495nm)。
三、LAB法(标记亲和素-生物素技术)
此法是以酶标亲和素连接生物素化抗体，从而间接检测结合于生物素化抗体上的特异性抗原。其过程是先使生物素化抗体与样品中相应抗原结合，再使酶标亲和素与结合在抗体上的生物素结合，最后经酶的显色反应显示样品内的抗原成分。
【材料】
1.包被缓冲液:碳酸缓冲液(pH9.5，0.05mol/L)。
2. 96孔酶标板。
3.包被用抗原: H Ig(人免疫球蛋白)。
4.待测抗体: RAH Ig(兔抗人免疫球蛋白血清)。
5.正常兔血清NRS(对照)。
6.酶标亲和素。
7.生物素化抗体。
8. PBS-T20(含0.5％Tween)。
9.底物(邻苯二胺，H2O2)。
10.终止液2mol/L H2SO4。
11.酶标仪，495nm滤光片。
【方法】
1. 96孔板内加人免疫球蛋白H Ig 1μg/ml，每孔100μl，置4℃18h。
2. PBS洗3次后加RAHIg/NRS(1∶1000～1∶1024000)，每孔100μl，置37℃1h，并设不加抗体的对照孔。
3. PBS洗3次并加SAR Gb(1∶10000)，每孔100μl，置37℃1h。
4. PBS-T洗3次并加ABC，每孔100μl，置22℃30min。
5. PBS-T洗3次并加生物素标记人Ig抗体37℃30min。
6. PBS洗后加酶标亲和素(HRP-Avidin) 37℃30min。
【结果】
同ABC法加底物及显色、观察结果。
【注意事项】
1. ABC法中的ABC复合物配制至关重要，生物素-亲和素之比一定按试剂盒要求混合。
2.生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环境中所产生的羧基载体。它可以存在于某些组织细胞中，在操作时与亲和素结合而产生特异性着色。在ABC法操作前预先用0.01％亲和素和0.01％生物素溶液分别作用20min，可消除其活性。
【思考题】
1.试举例说明常用的免疫学标记技术。
2.生物素-亲和素技术与酶联免疫吸附试验有什么区别?
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