与肺癌有关的癌基因和抑癌基因

第三节　与肺癌有关的癌基因和抑癌基因

随着分子生物学技术的发展，分子病理学研究也取得了很大进展。现就肺癌有关的癌基因、抑癌基因、细胞凋亡、端粒酶活性以及微卫星的不稳定性研究介绍如下。

一、癌基因、抑癌基因的检测

癌基因、抑癌基因的研究一直是分子生物学研究的热点。与细胞生长有关，在某种组织中促进生长并具有潜在致癌性的一类基因称为原癌基因，通常以非激活形式存在于正常细胞中。在特定条件下如化学致癌物、病毒等作用下，原癌基因发生突变、丢失、扩增、重排而成为癌基因。抑癌基因是一类与细胞生长有关，在某种组织中抑制生长并具有抑癌作用的基因。癌基因的异常扩增和抑癌基因的失活在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。检测基因突变可采用PCR-SSCP、DNA测序等;检测癌基因mRNA可采用原位PCR、原位杂交法;检测蛋白表达情况通常采用免疫组织化学法。原位杂交和免疫组织化学可结合形态观察，因而在病理学的研究中得到了广泛应用。

(一)p53基因

p53基因目前被公认是一种肿瘤抑制基因。由于P53蛋白能与细胞内多种蛋白结合，因此其作用是双向性的，既能调节细胞增生，又能诱发细胞凋亡，主要取决于环境的影响。

p53有野生型和突变型之分。一般认为野生型是一种抑癌基因，它可阻滞细胞G₁期，并在细胞毒抑制的细胞凋亡过程中起作用。p53的突变型是一种癌基因，在肺癌中最常见。尽管在p53基因中整个编码区域均可出现突变，但在肺癌中p53突变热点区域主要集中在5～8外显子。该基因突变类型为多样化，但以错义及无义突变、剪切异常和大片段缺失为主。70%的小细胞肺癌和50%的非小细胞肺癌存有p53突变，其中鳞癌、大细胞癌多于腺癌。

有研究表明吸烟可引起p53突变，多数为G→T颠换。一些不典型增生和原位支气管癌可证实P53蛋白的积聚，因此，p53过度表达可提示早期病变。文献报道p53的过度表达与组织学分化、淋巴结转移甚至化疗反应也有一定关系。主要原因是非小细胞肺癌的多药耐受性相关蛋白与p53的突变有关，导致对化疗药物的耐受，从而降低了对化疗的敏感性。

p53与预后的关系，报道不一，不能作为一个独立的预后指标。有人报道，在动物模型中注射转染野生型p53的肿瘤细胞株能抑制肿瘤的形成，进一步的实验采用β肌动蛋白启动子控制下的野生型p53构建的反转录病毒，将其直接注射到9例常规治疗失败的晚期非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中，结果3例患者出现肿瘤退化，其他3例不出现肿瘤生长;通过活检组织病理形态学观察，治疗后比治疗前具有更频繁的细胞凋亡现象。p53有望成为肺癌基因治疗的首选。

(二)ras基因

ras基因编码P21蛋白，由于能与GDT和GTP结合，故又称为G蛋白。G蛋白参与控制外界信号向下游的传递，因而控制细胞的生长和对外界信号的反应。

实验研究表明，当ras基因产物P21蛋白与GTP结合时就可诱导内源性GTPase的活化，从而将结合的GTP水解为GDP。一旦形成结合型GTP，Ras蛋白将处于活化状态，从而使生长信号传导至细胞核;但GTP水解后，Ras蛋白又恢复其失活状态并失去信号传导功能。因此，当ras基因发生突变时，Ras蛋白丢失其失活结构，导致异常的生长信号持续地传到细胞核并促使细胞加速分裂。

ras基因家族主要由k-ras、h-ras和n-ras所组成。肺癌以k-ras突变多见，其中大多分布在12，13，61密码子处，约有85%k-ras突变集中在12密码子处。文献报道20%～30%腺癌、21%大细胞癌及5%鳞癌存有k-ras突变。因此，ras基因的表达可作为肺腺癌的早期检测指标。小细胞肺癌几乎没有ras基因的表达。

非小细胞肺癌出现k-ras突变，则预后差。k-ras突变可在侵袭前发生，40%不典型腺瘤样增生发现有k-ras突变，腺癌也有相同的突变率。这也说明了不典型腺瘤样增生是一种癌前病变。

(三)myc基因

myc基因与ras基因相类似，可进行信号串联式传导，最终导致细胞核内原癌基因产物的活化。myc基因涉及正常细胞的生长和增生，并可直接激活DNA合成、RNA代谢及细胞加速分裂时的相关基因。Myc蛋白作为转录因子，参与细胞的增殖和凋亡。Myc蛋白表达增加表示细胞进入增殖周期，而其表达减少可使细胞发生凋亡。

myc基因族包括c-myc、n-myc、l-myc和r-myc。myc基因在肺癌中通常不发生突变，而是扩增。myc基因扩增主要存在于小细胞肺癌，约占80%～90%。myc基因的改变可能与小细胞肺癌的快速生长和浸润能力有关。化疗后复发的小细胞肺癌其myc基因表达水平高于治疗前水平。但在非小细胞肺癌，myc基因扩增表达仅为5%～10%。myc基因扩增明显的患者，其预后不佳。

(四)c-erbB-2基因(又称neu基因)

c-erbB-2基因参与细胞膜表面酪氨酸激酶生长因子受体的编码，而后者的激活可引起细胞的增生。c-erbB-2基因定位于17q21处，在肺癌细胞中基因扩增率不高，但可在30%～40%的非小细胞肺癌患者中出现高表达，其中以肺腺癌更为突出。免疫组织化学检测120例肺癌c-erbB-2蛋白的表达，其阳性率腺癌为80.5%，鳞癌为43.6%，大细胞癌为100%，小细胞肺癌没有表达。临床Ⅱ、Ⅲ期患者的阳性率(80.6%、87.5%)高于Ⅰ期患者(50.0%)。也有研究认为两者没有相关性，故c-erbB-2蛋白的表达与预后的关系，有待进一步研究。

体外实验提示，c-crbB-2基因高表达的非小细胞肺癌细胞株具有内源性多种化疗药物的抗药性，c-erbB-2基因低表达的非小细胞肺癌细胞株经转染后可出现基因高表达并诱导对化疗药物的抗药性。上述结果可解释c-erbB-2基因高表达的某些肺癌患者可能是造成其临床治疗疗效较差的原因之一。非小细胞肺癌可产生自分泌循环，既可产生类生长因子物质，又可产生生长因子受体，由此导致细胞的扩增。

(五)bcl-2基因/bax基因

过去认为bcl-2基因可促进细胞的增生，但最近的研究显示，bcl-2基因的表达主要能延迟或阻止细胞的凋亡。

实验表明一旦正常细胞遭受DNA损伤及无法修复时，可通过细胞内常规途径而导致细胞程序性死亡。当正常细胞转化为恶性肿瘤细胞时已不再具有此功能，从而出现逃逸细胞死亡的现象，导致肿瘤细胞无限制生长。目前被公认的涉及细胞凋亡途径的关键基因主要为bcl-2原癌基因和p53抑癌基因的产物，而其他细胞凋亡途径的基因也正在逐渐被证实中。

bcl-2基因是细胞凋亡的调控基因，通过抑制细胞凋亡而延长细胞的寿命，从而参与肿瘤的发生。最初报道见于滤泡性恶性淋巴瘤，随后发现较多实体瘤及部分正常组织均有表达。小细胞肺癌Bcl-2蛋白阳性率为90%，明显高于非小细胞肺癌(鳞癌20%～35%，腺癌10%)，并观察到Bcl-2蛋白阳性的非小细胞肺癌同时表达神经内分泌标志，可能与非小细胞肺癌的神经内分泌细胞分化相关。我们用免疫组织化学测得非小细胞肺癌Bcl-2蛋白的阳性率为33.8%，高于癌旁肺泡上皮(0%)、细支气管上皮(6.7%)及异型增生肺泡上皮(14.3%)，提示Bcl-2蛋白的超表达与部分肺癌的发生有关。有报道认为，在肺癌、乳腺癌、滤泡性恶性淋巴瘤中Bcl-2蛋白阳性者其预后较好。

bax基因与bcl-2基因属同一基因家族，前者可促进细胞凋亡，而后者抑制细胞凋亡。另外，bax基因已被人们认为属于p53基因下游转录的靶基因，并可能参与p53基因功能途径的一个组成部分。Bax蛋白可形成同源二聚体，也可与bcl-2基因产物形成异二聚体，并可通过bcl-2与Bax的比值换算而决定癌细胞的凋亡易感性程度。

(六)Nm23基因

Nm23基因是抑制肿瘤转移相关的基因，包括Nm23-H₁和Nm23-H₂两种类型。在人体肿瘤中Nm23的改变包括基因突变、等位基因丢失、mRNA转录及蛋白质翻译水平改变等，但其确切的机制尚不清楚。在恶性黑色素瘤、乳腺癌等中证实Nm23基因表达与肿瘤转移呈负相关。我们曾检测过非小细胞肺癌Nm23基因，与文献报道相符，而且临床分期越晚者，其Nm23基因表达越低。但也有相反或无关的报道。

(七)Rb基因(视网膜母细胞瘤基因)

Rb基因位于染色体13q14区域，是最早被证实为儿童视网膜母细胞瘤的抑癌基因。次磷酸化的Rb蛋白可结合并控制其他多种细胞蛋白，其中包括转录因子E2F-1(一种G₁/S期转化的必需因子)及Rb蛋白，还可拮抗E2F/DP异二聚体的形成，以阻断细胞从G₁期进入S期。这类抑制细胞G₁/S进程的机制已被人们认为是Rb抑癌基因的主要功能。在肺癌中能同时显示Rb基因突变与野生型Rb等位基因的丢失，肺癌中Rb基因突变可有多种类型。

小细胞肺癌中有80%以上发现Rb基因突变，而在非小细胞肺癌中约40%。有人认为Rb基因与小细胞肺癌的发生有关，Rb基因的突变造成细胞从G₀期向G₁期转化的调控受到破坏。与p53基因相似，Rb基因也与多药耐受性相关蛋白有关，它的突变和缺失使后者的表达增加。

(八)p16基因

p16基因家族p16^INK4a通过作用于G₀期向G₁期转化的启动程序，从而发挥抑制肿瘤生长的功效。p16/细胞周期蛋白D/CDK4/Rb途径是细胞周期中G₁期到S期转化调节的一个中心环节。p16在细胞周期的许多调节环节起到一个“闸”的作用。p16基因位于染色体9p21，在多种恶性肿瘤频繁出现等位基因丢失和突变。50%非小细胞肺癌存在p16^INK4a的突变，10%～40%的非小细胞肺癌患者中出现纯合性丢失和点突变，但少见于小细胞肺癌。

(九)其他基因

与肺癌发生和预后相关的基因还有很多，例如jun、fos、Rb1、Rb2、p27、fhit等基因，尽管上述基因的研究目前尚属早期阶段，但已显示与肺癌存在一定相关性。

二、细胞凋亡的研究

细胞凋亡(apoptosis)又称程序性死亡(programmed cell death)。不同于一般坏死，它是一种受基因调控有特征性形态改变的细胞死亡形式，对于维持正常组织细胞的动态平衡具有重要作用，肿瘤的发生、发展与它的失调有关。目前发现与细胞凋亡有关的基因有：促细胞凋亡基因、抑制细胞凋亡基因和细胞凋亡过程中的协助基因。如bcl-2、bax、p53、c-myc、ras及Rb均与细胞凋亡有关，其作用机制不尽相同。细胞凋亡是基因控制下细胞的主动死亡，在形态上具有一定的特征。文献报道，经过放疗、化疗的肿瘤细胞死亡主要是通过凋亡过程，因此，凋亡细胞的检测可提示放疗、化疗的疗效。细胞凋亡对于肿瘤的发生、分化、预后以及放疗、化疗、耐药性等方面的影响正受到人们的重视。王永早等研究发现非小细胞肺癌细胞凋亡发生率平均为2.8%，并且鳞癌自发性癌细胞凋亡发生率明显高于腺癌。肺癌自发性癌细胞凋亡与肿瘤的分化程度有关，分化越低，细胞凋亡发生率越高，提示细胞凋亡可以作为判定肺癌预后的一个潜在指标。

三、端粒酶活性检测

在老化过程中，人的体细胞每次分裂后染色体的末端逐渐丢失而缩短，但癌细胞和永生化细胞则可维持其端粒长度。这是因为癌细胞和永生化细胞以及生殖细胞等可表达一种重要的核糖蛋白酶即端粒酶(telomere)。多数恶性肿瘤能检测到端粒酶活性。端粒酶的活性不仅与肿瘤的良、恶性有关，而且可能与肿瘤的分化、复发和转移有关。肺癌组织端粒酶活性阳性率报道一般在70%～90%，大部分小细胞肺癌早期伴有端粒酶活性的异常改变。刘虹等对非小细胞肺癌的研究表明，非小细胞肺癌端粒酶活性阳性率为75%，与癌旁肺组织及正常肺组织端粒酶活性阳性率比较差异有显著性，表明端粒酶活化在非小细胞肺癌的发生、发展中起重要作用。端粒酶活性阳性率与非小细胞肺癌的组织学分级和TNM分期有关，随着组织学分级和TNM分期的增高，端粒酶活性阳性率也增高。端粒酶活性有望成为预测肿瘤发生和诊断的良好指标，端粒、端粒酶也可能成为抗肿瘤治疗的新靶点。

四、微卫星不稳定性

微卫星重复片段(现已知为短片段串联重复或单一序列重复)具有高度多态性并广泛分布在基因组，已被作为基因标志而广泛地应用于基因图谱分析和少量肿瘤组织的杂合性缺失研究。微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是表示DNA短片段串联重复数量的差异，最初被发现于散发性结、直肠癌及遗传性非息肉性结肠癌，其主要表现为DNA错配修复基因的突变。直肠癌的微卫星不稳定性可同时影响多处遗传位点，而肺癌通常仅在个别位点处显示不稳定。有资料显示约有35%的小细胞肺癌和22%的非小细胞肺癌在某独特位点上出现微卫星不稳定性。微卫星不稳定性被认为是20世纪极其重要的一个研究领域，但对微卫星不稳定性的正确评价、其在肺癌发生中所起的作用以及能否通过微卫星不稳定性的检测协助肺癌的诊断等问题仍有待进一步研究。

分子生物学新技术将为肺癌研究带来变革性进步，人类基因组序列草图的完成，可在全基因水平探讨癌的基因表达异常，大大加速疾病分子机制研究的进程。通过深入研究癌前病变以及早期肺癌伴随的基因改变规律，采用形态学和分子生物学相结合的方法，以期对肺癌的早期诊断、合理的治疗及预后判断提供新手段。