猫爪草正丁醇提取部位大孔吸附树脂洗脱部位的柱层析分离

（一）主要仪器和材料

WRS－1B数字熔点测定仪（未校正）、X4型显微熔点测定仪、Perkin－Elmer　983G红外光谱仪、Bruker ARX600核磁共振仪（TMS内标）、Autospec Ultima－TOF型质谱仪、制备高效液相色谱仪、中压液相色谱仪、旋转薄膜蒸发器、层析预柱。葡聚糖凝胶LH－20、聚酰胺、柱层析用硅胶G（100～200目）、硅胶H及薄层层析用硅胶G及石油醚、氯仿、乙酸乙酯等试剂。猫爪草正丁醇提取部位大孔吸附树脂30%乙醇、50%乙醇洗脱部位。

（二）方法

大孔吸附树脂30%乙醇的洗脱部分（65g），用硅胶拌样后经硅胶柱层析，氯仿－甲醇－水（8．0∶2．5∶0．5下层洗脱，洗脱液减压回收溶剂。以0．3%CMC－Na的硅胶G板，以CHCl3－MeOH－H2O（65∶35∶10）下层为展开剂展开，以5%磷钼酸试液、硫酸乙醇试液为显色剂显色，进行薄层层析检视，合并相同组分，得80份。其中20～50份合并，经反复中压柱层析，CHCl3－MeOH－H2O（75∶25∶10）下层洗脱，合并相同组分，得化合物Ⅰ（15mg）；51～80份合并，经反复中压柱层析CHCl3－MeOH－EtOAc－H2O（2∶2∶4∶1）下层洗脱，合并相同组分，LH－20凝胶柱层析，50%甲醇洗脱，得化合物Ⅱ（23mg）和化合物Ⅲ（20mg）。

大孔吸附树脂50%乙醇的洗脱部分（35g），用硅胶拌样后经硅胶柱层析，氯仿－甲醇（95∶5～50∶50）梯度洗脱，洗脱液减压回收溶剂，得150份。以0．3%CMC－Na的硅胶G板，以CHCl3－MeOH－H2O（65∶35∶10）下层等为展开剂展开，以5%磷钼酸乙醇液、硫酸乙醇溶液为显色剂显色，进行薄层层析检视，合并相同组分，将量多的组分再进行柱层析。其中20～50份合并，经反复中压柱层析，CHCl3－MeOH－H2O（65∶35∶10）下层洗脱，得化合物Ⅳ（15mg）；51～100份合并，经反复中压柱层析，氯仿－甲醇（含5%水）（95∶5）洗脱，得化合物Ⅴ（20mg）。

（三）结构鉴定与分析

化合物Ⅰ：无色胶状物（甲醇），经鉴定化合物Ⅰ为4－氧代－5－（－O－β－D－葡萄糖基）戊酸正丁基酯4－0－5－（－O－β－D－glucose）valeric acid－n－butylester，结构如下。

解析过程：mp　207～208℃，阳性EI－MS m／z　373．2!M＋Na"＋，189．2!M－162＋H"＋；阴性EI－MS m／z　349．3!M－H"＋；HRFABMS m／z　373．1426［M＋Na］＋。1　HNMR（DMSO－d6，500MHz），13CNMR（DMSO－d6，125MHz），结果分析见表3－45。

表3－45　1HNMR（DMSO－d6，500MHz），13　CNMR（DMSO－d6，125MHz）

化合物Ⅱ：棕色胶状物（甲醇），经分析鉴定为：（R）－3－［3－羟基－4－（－O－β－D－葡萄糖基）－苯基－］－2－羟基丙酸－正丁基酯（R）－3－［3－hydroxyl－4－（－O－β－D－glucose）phenyl］－2－hydroxylacetic acid－n－butylester，其结构如下。

解析过程：mp　182～183℃，Molish反应呈阳性，Libermann－Burnchard反应呈阳性EI－MS m／z　439．2!M＋Na"＋，255．2!M－162＋H"＋；阴性EI－MS m／z　415．3!M－H"＋；HRFABMS m／z　439．1551［M＋Na］＋1　HNMR（DMSO－d6，500MHz），13　CNMR（DMSO－d6，125MHz），见表3－46。

表3－46　1HNMR（DMSO－d6，500MHz），13　CNMR（DMSO－d6，125MHz）

化合物Ⅲ：白色结晶（MeOH），经分析鉴定为豆甾醇－3－O－β－D－葡萄糖苷，其结构如下。

解析过程：mp　182～184℃，Molish反应呈阳性，Libermann－Burnchard反应呈阴性。EIMS：588．9（M＋），536．3，475．7，454．6，362．7，224．6，102．4，66．4，1　HNMR：0．56，0．75，0．94，0．94，1．01，1．03（6个CH3）3．6（1H，m，3－H），4．2（1H，d），5．0（2H，m，22－H，23－H），0．31（1H，6－H）．13　CNMR：38．3，31．4，77．0，42．0，140．0，121．0，31．8，49．6，50．6，36．8，20．2，39．8，45．2，56．3，24．9，28．7，55．3，12．2，19．8，40．3，21．2，137．9，128．712，8．7，55．4，29．3，18．2，19．1，25．5，11．9，100．6，73．4，76．7，69．8，67．8，60．9，EI－MS：588．9（M＋），536．3，475．7，454．6，362．7，224．6，102．4，66．4，1　HNMR，13　CNMR：葡萄糖基：1′：δH4．90（d，1H，7．5）δC101．6，2′：δH3．06（t，1H，7．5）δC77．7，3′：δH3．44（t，1H，7．5）δC77．5，4′：δH3．30（t，1H，7．5）δC74．2，5′：δH3．65（m，1H，7．5）δC70．9，6′：δH（dd，2H，13．5，7．5）　δC61．9，豆甾醇基：基本骨架信息与葫芦烷一致。

化合物Ⅳ：无色胶状物，鉴定该化合物为4－氧代－5－（O－β－D－葡萄糖基）－戊酸甲酯。

解析过程：1　HNMR（D2O）D：2．55（2H，t，J＝6．5Hz，H－2），2．74（2H，t，J＝6．5Hz，H－3），3．57（3H，s，H－6），4．35（1H，d，J＝7．5Hz，Glu－H－1），4．43，4．54（2H，d，J＝17．5Hz，H－5）。13CNMR（D2O）D：27．3（C－2），33．4（C－3），52．4（C－6），60．7（Glu－C－6），69．6（Glu－C－4），73．1（C－5），73．5（Glu－C－2），75．6（Glu－C－3），76．1（Glu－C－5），102．2（Glu－C－1），175．9（C－1），208．9（C－4）。上述NMR数据与化合物Ⅶ比较，少了一组正丁基的信号，而多了一个甲氧基的信号，故而得出以上结论。

化合物Ⅴ：白色粉末，维太菊苷一致。解析过程为：mp　273～276℃，IR（KBr）cm－1：3　400（OH），2　960，2　930，1　660（C＝C），1640（C＝C），1　460，1　380，1　080，1　020。ESIMS m／ z（%）：575（M＋＋1），412（M＋－162），394（M＋－162－H2O），275，255，213，83，69，43。与维太菊苷对照品混合熔点不下降。

化合物Ⅵ：淡黄色粉末，该化合物为罗波斯塔黄酮－4′－甲醚。

解析过程：ESI－MSmz：551［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．19（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．49（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．63（1H，s，H－8″），6．81（1H，s，H－3），6．86（1H，s，H－3″），6．93（2H，d，J＝9．0Hz，H－3，5），7．23（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．82（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），7．95（2H，d，J＝9．0Hz，H－2，6），8．07（1H，dd，J＝2．5，9．0Hz，H－6′），3．79（3H，s，OCH3），12．9，13．2（各1H，s，5″，5，5－OH），10．4（1H，s，4－OH），10．8（2H，s，7，7″－OH）。13　CNMR（DMSO－d6）D：56．5（OCH3），94．1（C－8″），94．8（C－8），99．6（C－6），103．6（C－3），104．2（C－3″），104．2（C－10″），104．5（C－10），109．3（C－6″），112．4（C－5′），116．7（C－3，5），121．9（C－1），123．1（C－3′），123．3（C－1′），128．6（C－6′），129．2（C－2，6），131．0（C－2′），157．1（C－9″），158．1（C－9），159．6（C－4），161．4（C－5），161．9（C－5″），162．1（C－7″），162．6（C－4′），164．1（C－7），164．4（C－2），164．9（C－2″），182．4（C－4），182．6（C－4″）。上述NMR数据与罗波斯塔黄酮－4′－甲醚报道一致。

化合物Ⅶ：淡黄色粉末，为榧双黄酮。

解析过程：ESI－MSmz：579［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．17（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．46（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．65（1H，s，H－6″），6．90（1H，s，H－3″），6．91（2H，d，J＝9．0Hz，H－3，5），6．92（1H，s，H－3），7．33（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．59（2H，d，J＝9．0Hz，H－2，6），8．05（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），8．16（1H，dd，J＝2．5，9．0Hz，H－6′），3．76（3H，s，OCH3），3．80（3H，s，OCH3），3．82（3H，s，OCH3），12．9，13．2（各1H，s，5″，5－OH），10．8（1H，s，7－OH）。13 CNMR（DMSO－d6）D：55．5（OCH3），55．9（OCH3），56．5（OCH3），94．8（C－8），96．3（C－6″），99．7（C－6），103．9（C－3″），104．5（C－10″），104．5（C－3），104．8（C－10），105．3（C－8″），112．5（C－5′），115．2（C－3，5），121．9（C－3′），123．3（C－1′），123．4（C－1），128．6（C－2，6），129．0（C－6′），131．5（C－2′），154．1（C－9″），158．1（C－9），161．0（C－4′），162．1（C－5″），161．2（C－5），163．0（C－4），163．3（C－7″），163．9（C－2），164．2（C－2″），164．9（C－7），182．5（C－4），182．8（C－4″）。HMBC谱中3个OCH3上的氢分别和4′，4，7″位碳相关，2′位氢和8″位碳及6′位碳相关，说明OCH3连在4′；4，7″位，双黄酮的两部分通过3′，8″位连在一起。上述NMR数据与榧双黄酮文献报道一致。

化合物Ⅶ：淡黄色粉末，为罗汉松双黄酮A。

解析过程：ESI－MSmz：551［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．07（1H，s，H－6″），6．14（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．20（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．70（2H，d，J＝8．5Hz，H－3，5），6．74（1H，s，H－3），6．78（1H，s，H－3″），6．92（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．75（2H，d，J＝8．5Hz，H－2，6），7．88（1H，dd，J＝2．5，9．0Hz，H－6′），8．22（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），3．60（3H，s，OCH3），13．0，13．1（各1H，s，5″，5－OH）。13　CNMR（DMSO－d6）D：55．2（OCH3），93．9（C－8），98．6（C－6″），101．3（C－6），102．3（C－3），103．0（C－3″），103．0（C－10），103．5（C－10″），103．9（C－8″），114．1（C－3，5），118．4（C－5′），118．9（C－1），122．9（C－3′），123．3（C－1′），126．6（C－6′），126．9（C－2，6），131．4（C－2′），154．7（C－9），157．3（C－9″），160．5（C－4），161．4（C－5），161．7（C－5″），162．3（C－4′），163．7（C－7″），163．9（C－7），164．5（C－2″），164．5（C－2），181．5（C－4），181．6（C－4″）。HMBC谱中OCH3上的氢和4位碳相关，2′位氢和8″位碳及6′位碳相关，说明OCH3连在4位，双黄酮的两部分通过3′，8″位连在一起，上述数据与罗汉松双黄酮A文献报道一致。

化合物Ⅷ：淡黄色粉末，为去甲银杏双黄酮。

解析过程：ESI－MSmz：551［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．11（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．27（1H，s，H－6″），6．39（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．70（2H，d，J＝9．0Hz，H－3，5），6．69（1H，s，H－3″），6．81（1H，s，H－3），7．28（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．47（2H，d，J＝9．0Hz，H－2，6），HdJHzHHddJ2．5，9．0Hz，H－6′），3．75（3H，s，OCH3），12．9，13．1（各1H，s，5，5″－OH）。13 CNMR（DMSO－d6）D：56．4（OCH3），94．9（C－8），99．9（C－6″），99．9（C－6），102．9（C－8″），103．2（C－3″），103．9（C－3），104．1（C－10″），104．5（C－10），112．2（C－5′），116．5（C－3，5），121．9（C－3′），121．9（C－1），123．2（C－1′），128．4（C－2′），128．6（C－2，6），131．7（C－6′），155．1（C－9″），158．2（C－9），161．1（C－4），161．3（C－5″），161．9（C－7″），162．1（C－4′），162．1（C－5），163．7（C－7），163．9（C－2″），166．4（C－2），182．2（C－4″），182．3（C－4）。HMBC谱中OCH3上的氢和4′位碳相关，2′位氢和8″位碳及6′位碳相关，说明OCH3连在4′位，双黄酮的两部分通过3′，8″位连在一起，上述数据与去甲银杏双黄酮文献报道一致。

化合物Ⅸ：淡黄色粉末，确定该化合物为异银杏双黄酮。

解析过程：ESI－MSmz：565［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．18（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．40（1H，s，H－6″），6．46（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．88（2H，d，J＝8．0Hz，H－3，5），6．90（1H，s，H－3″），6．92（1H，s，H－3），7．33（1H，d，J＝8．5Hz，H－5′），7．58（2H，d，J＝8．0Hz，H－2，6），8．02（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），8．16（1H，dd，J＝2．5，8．5Hz，H－6′），3．73（3H，s，OCH3），3．77（3H，s，OCH3），12．9，13．0（各1H，s，5，5″－OH），10．8（2H，s，7，7″－OH）。13　CNMR（DMSO－d6）D：56．2（OCH3），56．6（OCH3），94．8（C－8），99．3（C－6″），99．6（C－6），103．3（C－8″），104．3（C－3″），104．4（C－3），104．4（C－10″），104．6（C－10），112．4（C－5′），115．2（C－3，5），122．3（C－3′），122．3（C－1），123．2（C－1′），128．5（C－2′），128．9（C－2，6），131．6（C－6′），155．0（C－9″），158．1（C－9），161．1（C－4′），161．3（C－5″），162．1（C－4），162．5（C－5），162．9（C－7″），163．8（C－7），164．0（C－2），164．9（C－2″），182．5（C－4″），182．8（C－4）。上述数据与异银杏双黄酮文献报道一致。

化合物Ⅹ：淡黄色粉末，易溶于丙酮，经解析过程确证该化合物为穗花杉双黄酮。

解析过程：ESI－MSmz：537［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．18（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．40（1H，s，H－6″），6．46（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．71（2H，d，J＝9Hz，H－3，5），6．78（1H，s，H－3″），6．82（1H，s，H－3），7．14（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．56（2H，d，J＝9．0Hz，H－2，6），7．98（1H，dd，J＝2．5，9．0Hz，H－6′），8．00（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），13．1，13．2（各1H，s，5，5″－OH），10．8，10．3（各1H，s，7，7″－OH）。13　CNMR（DMSO－d6）D：94．7（C－8），99．3（C－6″），99．5（C－6），103．3（C－3″），103．7（C－10），104．3（C－3），104．4（C－10″），104．6（C－8″），116．5（C－3，5），116．8（C－5′），120．7（C－3′），121．7（C－1′），122．1（C－1），128．5（C－6′），128．9（C－2，6），132．1（C－2′），155．2（C－9″），158．1（C－9），160．2（C－4′），161．2（C－5″），161．7（C－5），162．1（C－4），162．5（C－7″），164．4（C－7），164．5（C－2″），164．8（C－2），182．4（C－4），182．8（C－4″）。上述NMR数据与穗花杉双黄酮文献报道一致。

化合物Ⅺ：无色胶状物，鉴定该化合物为4－氧代－5－（O－β－D－葡萄糖基）－戊酸甲酯。

解析过程：1　HNMR（D2O）D：0．95（3H，t，J＝7．5Hz，H－9），1．39（2H，m，J＝7．5Hz，H－8），1．61（2H，m，J＝7．5Hz，H－7），2．59（2H，t，J＝6．5Hz，H－2），2．86（2H，t，J＝6．5Hz，H－3），4．08（2H，t，J＝7．5Hz，H－6），4．31（1H，d，J＝7．5Hz，Glu－H－1），4．34，4．50（2H，d，J＝17Hz，H－5）。上述NMR数据与文献报道一致。

化合物Ⅻ：无色胶状物，鉴定该化合物为4－氧代－5－（O－β－D－葡萄糖基）－戊酸甲酯。

解析过程：1　HNMR（D2O）D：2．55（2H，t，J＝6．5Hz，H－2），2．74（2H，t，J＝6．5Hz，H－3），3．57（3H，s，H－6），4．35（1H，d，J＝7．5Hz，Glu－H－1），4．43，4．54（2H，d，J＝17．5Hz，H－5）。13 CNMR（D2O）D：27．3（C－2），33．4（C－3），52．4（C－6），60．7（Glu－C－6），69．6（Glu－C－4），73．1（C－5），73．5（Glu－C－2），75．6（Glu－C－3），76．1（Glu－C－5），102．2（Glu－C－1），175．9（C－1），208．9（C－4）。根据上述NMR数据可确定为该化合物为4－氧代－5－（O－β－D－葡萄糖基）－戊酸甲酯。

化合物ⅫⅠ：无色结晶（甲醇），确证该化合物为苯甲醇O－β－D－葡萄糖苷。

解析过程：1　HNMR（D2O）D：7．17～7．35（5H，m），4．80，4．61（2H，d，J＝11．5Hz），4．38（1H，d，J＝8．0Hz，Glu－H－1）。13　CNMR（D3O）D：136．8（C－1），129．7（C－3，5），128．9（C－2，6），128．6（C－4），69．6（C－7），101．4（Glu－C－1），76．1（Glu－C－5），75．9（Glu－C－3），73．3（Glu－C－2），71．6（Glu－C－4），61．0（Glu－C－6）。

（四）小结

猫爪草正丁醇提取部位经大孔吸附树脂技术梯度洗脱，然后使用硅胶吸附层析、中压液相硅胶柱层析（MPLC）及羟丙葡聚糖凝胶柱层析（Sephadex LH－20）等多种层析分离技术进行分离，利用Mp［α］，EI－MS，NMR，2DNMR等现代分析技术鉴定13个化合物，分别为4－氧代－5－（－O－β－D－葡萄糖基）－戊酸－正丁基酯和（R）－3－［3－羟基－4－（－O－β－D－葡萄糖基）－苯基－］－2－羟基丙酸－正丁基酯和豆甾醇－3－O－β－D－葡萄糖苷等。

近10年来虽然我国许多学者对猫爪草化学成分进行了较深入的研究，但分离得到苷类成分仅见有β－谷甾醇和豆甾醇二者D－葡萄糖苷的混合物及胡萝卜苷等。此实验分离鉴定的3个苷类成分均是首次从该类植物中得到，前2个为新化合物，后一个为已知成分。