表观遗传与衰老及干细胞治疗

衰老（aging）是指生物体随着年龄增长逐渐丧失正常功能并最终走向死亡的过程。年龄是几乎所有慢性疾病的第一危险因素。延缓衰老不仅可以降低疾病发病率，减轻社会负担，还能够使有经验的个体更长期地为社会创造财富。可喜的是，在过去的100余年时间，通过改善环境及医疗水平，人类的平均寿命已经大大延长了（1915年只有约55岁）。当然随着寿命延长，社会年龄结构趋向老年化，衰老相关疾病也越来越常见。因此，衰老以及年龄相关疾病的生物医学研究显得越发重要。

需要指出的是，虽然有关联性，但是延长寿命并不能简单地与延缓衰老划等号。本节的讨论集中在“如何在分子层面上通过表观遗传原理来理解衰老”。换句话说，一个年轻的细胞和一个衰老的细胞所含有的基因组是一样的，但是表现出来的表型却是不同的，那么在表观遗传层面上两者究竟有什么不同？准确探究其中的规律对我们理解并延缓衰老十分关键。

一、衰老

（一）关于衰老的多种假说

关于衰老的原因存在多种假说。例如，氧化损伤假说、衰老基因假说、干细胞假说及表观遗传假说等。

1.氧化损伤假说 在生物体内的生物大分子（蛋白质、脂质、DNA与RNA）均会发生不同程度的氧化损伤，特别是DNA损伤，被认为是引起衰老的主要原因。随着DNA损伤积累到不可逆的程度，细胞将进入衰老。由于DNA损伤导致多细胞生物个体各器官与组织中细胞（特别是干细胞）损坏，将导致个体的衰老。在氧化损伤假说中线粒体处于重要的位置，线粒体是细胞内生成活性氧（ROS）的主要细胞器，线粒体的损伤或功能低下将导致活性氧增加，从而导致氧化损伤发生。

2.衰老基因假说 该假说认为，生物体基因组中存在控制衰老的关键基因，这些基因驱动了衰老过程的发生。然而，到目前为止还没有发现真正意义的衰老基因。需要特别指出的是，遗传学家已经鉴定出一些早衰症状的遗传性疾病。例如，Hutchinson－Gilford早老综合征（HGPS）的致病基因及其突变。这些致病基因通常是DNA修复或核骨架相关基因。此外，染色体端粒对于稳定基因组十分关键，其长度也被认为与衰老相关。人类正常细胞每分裂一代端粒就减短一些，一般分裂50～60代后，就由于端粒过短而不可避免地进入衰老和凋亡期。

3.干细胞假说 高等生物个体稳态维持与再生修复依赖于其体内的各种成体干细胞。随着年龄增长，生物体内干细胞储备逐渐减少并伴随着机体再生修复能力的逐渐降低。因此，干细胞衰老或数量的衰竭被认为是高等生物衰老在细胞层面的核心原因。

4.表观遗传假说 表观遗传调控是外界环境与内在遗传信息交互的重要桥梁，在衰老及与年龄相关疾病中起重要作用。随着表观遗传学的发展，人们对于衰老的表观遗传机制也有了更多的认识，并逐步形成了衰老的表观遗传假说。

表观遗传调控在衰老过程中发挥重要作用的证据主要包括以下几个方面：①衰老伴随着广泛的表观遗传修饰变化（例如，DNA甲基化与组蛋白共价修饰，编码与非编码RNA）；②一些影响衰老进程的外界因素［例如，紫外线（UV）对于皮肤衰老］影响表观遗传修饰；③最为重要的一点是，在一些低等生物（例如，酵母、线虫及果蝇）中改变表观遗传修饰已被证明可以影响衰老进程与寿命。衰老表观遗传假说从分子调控层面解释了其他假说如何具体发挥作用。因此，在衰老研究中具有非常重要的意义和广阔的应用前景。

表观遗传修饰与调控主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及非编码RNA。多种表观遗传修饰与调控相互协同作用共同构成了复杂的表观遗传调控网络。早期胚胎发育过程中表观遗传修饰发生了剧烈的变化，逐步建立起相对稳定的表观基因组，而生物体衰老过程也伴随着各组织细胞缓慢的表观遗传变化。这里总结了几种主要表观遗传修饰与调控在生物体衰老过程中的变化。

（1）DNA甲基化：DNA甲基化一般发生在CpG上，是目前研究最为深入的一种表观遗传修饰。基因组DNA中CpG并非随机分布，在一些CpG密集的区域（通常是CpG岛），这些位置往往不发生DNA甲基化。CpG岛具有募集转录起始复合物的功能，成为基因启动子，一旦这些区域发生甲基化通常导致该基因启动子染色质结构致密并且转录沉默。在基因组DNA中还存在大量非基因编码的重复序列（其中包含大量的病毒同源序列）。这些区域的CpG通常发生DNA甲基化，从而促进这些区域形成致密的异染色质结构，有利于维持基因组的稳定性。在衰老过程中的一个普遍现象是：总的基因组DNA甲基化水平降低，但有些基因位点的DNA甲基化增加。基因组的低甲基化主要发生在重复序列处，如Alu序列。而高甲基化主要发生在一些基因的CpG岛。例如，一些肿瘤生长相关基因［如ER、IGF和E钙黏着蛋白（cadherin）］和发育相关基因。此外，在血液细胞里，研究发现二价结构域（bivalent domain）调控的基因在衰老的过程中也更倾向于发生DNA甲基化。这些发现说明，衰老的过程伴随着这些早期发育和生长相关基因的转录沉默，衰老的细胞也因此逐渐丧失生命的活力。但是为什么这些基因会有选择性地被沉默？是否能够通过调控DNA甲基化而延缓衰老？与此假想相关的研究发现，通过药物（5－Aza）或是RNA干扰DNMT抑制DNA甲基化有助于打开已关闭的多能性基因，并促进细胞重编程。另外，在DNA去甲基化酶方面，研究发现小鼠造血干细胞随着年龄增加Tet1和Tet3的表达水平减少，相应的DNA羟甲基化水平也降低。

特别需要提到的是，由于DNA甲基化和年龄相关，近年来多家实验室尝试利用基因组DNA甲基化预测年龄取得令人满意的结果。2013年，Horvath分析了51种健康人类组织和细胞类型的CpG岛DNA甲基化水平，发现DNA甲基化和细胞代数有着高相关性，建立了使用353个特异性CpG位点甲基化精确预测个体年龄的模型。2014年，Weidner基于Harvath的发现，找到102个更为特异的位点，通过检测血液样品的甲基化水平能将预测精度缩到5年以内，其精度高于基于端粒长度的预测方法。

尽管DNA甲基化是衰老表观遗传学中研究最为广泛和深入的修饰，然而DNA甲基化的变化究竟是衰老的原因还是结果目前还不清楚。此外，DNA甲基化水平随着衰老发生变化的具体分子机制也还在研究之中。

（2）组蛋白共价修饰：染色质核小体中的组蛋白同样存在共价修饰。例如，甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等。组蛋白的这些共价修饰（又被称为“组蛋白密码”）也对染色质结构与基因转录起着非常重要的调节作用，是表观遗传调控的重要组成部分。在衰老过程中多种组蛋白共价修饰的水平也被检测到发生了明显变化。例如，H4K20me3、H3S10磷酸化、H3K9与H4K16乙酰化增加，H3K9me3、H3K27me3减少。

NAD＋依赖的Sirtuin家族蛋白具有去乙酰化酶与ADP核糖转移酶活性，可以催化组蛋白去乙酰化（也可以催化非组蛋白的去乙酰化）与ADP核糖基化。在细胞的衰老过程中该家族蛋白的表达或酶活性降低，同时伴随着H4K16乙酰化水平的增加。在酵母中激活Sir2活性或抑制乙酰转移酶Sas活性均可延长细胞寿命。白藜芦醇（resveratrol，一种在红酒中发现的抗衰老分子）的抗衰老作用也被认为部分通过激活Sirt1介导，其延长衰老的作用不仅在酵母中还在一些多细胞生物中得到验证。

在组蛋白甲基化方面，研究发现转录激活标记H3K4me3和转录抑制标记H3K27me3水平也影响成体干细胞的静息、自我更新和分化而改变。Liu等分离了青年小鼠和老年小鼠的骨骼肌干细胞，检测全基因组组蛋白修饰甲基化的水平，发现相比青年小鼠，老年小鼠的H3K4me3水平下降而H3K27me3上升，染色质区域沉默，基因表达抑制。该项研究提示，伴随着衰老过程的功能退化可能是由于染色质修饰的累积造成的。与此相关的是，在重编程的研究中发现EZH2的甲基转移酶激活有助于重编程过程，也说明通过调控H3K27me3水平和分布有助于抹去细胞已有的“旧的记忆”，并恢复到干细胞状态。也有研究认为，EZH2在此过程中的功能至少部分依赖于抑制p16INK4A的转录，从而激活细胞周期，帮助表观遗传信息的重编程。

（3）染色体重塑复合物与非编码RNA：除了DNA与组蛋白上的表观遗传修饰外，细胞核内还存在ATP依赖的染色质重塑复合物，对染色质结构起着重要的调控作用。SWI2／SNF2染色质重塑复合物的组分之一科凯恩综合征互补组蛋白B（Cockayne syndrome complementation group B，CSB）突变导致的Cockayne综合征具有早衰的表型。2014年， Shelley Berger实验室在酵母中发现抑制ISW2复合物可以延长细胞寿命，同样的在线虫中干扰ISWI复合物也具有延长寿命的效果。

真核细胞基因组除了转录编码蛋白的mRNA，还转录大量的非编码RNA。近年来，非编码RNA也被发现在表观遗传调控中发挥重要作用。例如，一些调控胰岛素／胰岛素样长因子－1（Insulin／IGF－1）通路关键基因的miRNA被认为可能参与了衰老相关的表型的调节。此外，长链非编码RNA在衰老过程中的变化与作用也正在成为衰老表观遗传学研究领域的热点之一。

（二）抗衰老的策略

目前，对于抗衰老与延长寿命的方法中最为著名的是饮食限制（dietary restriction）。这个方法不仅在多种低等生物（酵母、线虫及果蝇）中证明有效，在高等生物小鼠与猴中也被证明有效。饮食限制引起生物体细胞的变化较为复杂，其中有一种可能性是通过激活上文提及的Sir2蛋白（或是其同源物SIRT1）来改变表观遗传组，从而达到延缓衰老过程的作用。其具体作用机制也是当前衰老研究领域的热点。

近年来，一些小分子化合物也被发现具有抗衰老作用。例如，白藜芦醇（resveratrol）和西罗莫司（rapamycin），在低等生物及高等生物中均被证明可以延缓衰老和延长寿命。

最近，抗衰老领域最令人惊叹的进展是，多个实验研究发现，当把年轻与年老小鼠血液循环相连一段时间后，老年小鼠多个器官的衰老表型被逆转。Conboy等发现，连接年轻小鼠血液循环的年老小鼠，其肌肉细胞的修复能力恢复到年轻小鼠水平。其后，Villeda也利用相同模型证明了成年小鼠神经系统的再生和认知的衰老是可逆的，暗示着年轻小鼠的血液中可能具有某些活性物质与抗衰老相关。2014年，Rubin和Wagers找到了生长和分化因子（GDF11），这一活性蛋白可以解释上述现象，即向老年小鼠注射GDF11能够促进脑血管新生和神经系统发生，故而推断GDF11这样的血液因子在抗衰老领域具有极大的临床价值。可以预见的是，系统性地研究GDF11对各器官表观遗传组的影响是必须的。其结果将帮助我们了解在这种“逆衰老”过程中，表观遗传层面究竟发生了一些什么，并为未来的实际应用建立理论基础。

二、干细胞治疗

干细胞（stem cell）具有自我更新能力和分化潜能，是生物体发育、稳态维持与再生修复的源泉。干细胞不仅是研究胚胎发育与细胞分化的重要模型，更被认为是治疗多种疾病的重要手段之一。人体各器官与组织通常随着年龄增长，成体干细胞的储备数量逐渐降低，并最终耗竭，这可能是导致衰老与死亡的直接原因。很显然，随着人们对各种组织干细胞研究的深入，在不远的将来可以实现干细胞治疗来延缓人体的衰老。在过去的几十年里人们已经在广泛的探索从胚胎干细胞或各种成体干细胞定向分化成相应的功能性细胞或前体细胞，从而应用于各种疾病的细胞替代治疗，包括目前临床上应用于造血系统恶性肿瘤治疗的骨髓移植，其中起关键作用的即为造血干细胞（HSC）。

2006年日本科学家Yamanaka等发明的诱导多潜能性干细胞（induced pluripotent stem cell，i PSC）技术是干细胞与再生医学领域的重大突破。他们首次发现过表达4个转录因子（OSKM）可以把已经分化的小鼠成纤维细胞重编程到具有多潜能性（pluripotency）的胚胎干细胞样细胞。2007年，世界上多个实验室相继报道i PSC技术同样可以应用于人类细胞。i PSC技术的发明使得干细胞研究绕开了卵细胞与胚胎的伦理问题，同时还让异体免疫排斥问题几乎得到了完美的解决。传统的i PSC技术借助病毒或者转座子等载体导入外源基因，可能影响细胞原有基因组，存在潜在的安全性问题。2013年，我国科学家邓洪魁等发现使用6种小分子化合物也能够重编程小鼠成纤维细胞为i PSC，是解决i PSC携带外源基因隐患问题的里程碑性质的进展。

世界上许多实验室已经在尝试把i PSC定向分化为功能性细胞，应用于治疗多种疾病。目前，在视网膜黄斑病变、1型糖尿病等疾病取得了可喜的进展，多项临床实验的结果也相当鼓舞人心。除了将分化的细胞重编程为胚胎干细胞样全能干细胞，最近几年里将体细胞重编程为特定组织干细胞也取得了重要的进展。目前，人们通过过表达一些特定的转录因子及辅助一些特定的细胞因子与小分子化合物成功地将成纤维细胞重编程为神经干细胞、神经元、胶质细胞、肝细胞、胰岛细胞、心肌细胞等。可以预见，在不久的将来，各种人体重要器官与组织的重编程干细胞将会给生物医学领域带来革命性的影响。

各种干细胞或重编程获得的细胞除了应用于细胞移植治疗外，还可体外模拟疾病发生过程，用于研究分子机制及进行药物筛选。例如，阿尔海默病等神经退行性病变患者的皮肤成纤维细胞也被重编程为i PSC，开始用于体外研究发病机制与药物筛选。此外，最近有多家实验室将罕见的早衰遗传患者的皮肤成纤维细胞重编程为i PSC并用于药物筛选，给这些罕见的早衰遗传患者带来了曙光。

特别值得一提的是，细胞重编程的过程本身被认为是细胞核表观遗传基因组重新设定的一个过程，表观遗传修饰酶如DNMT、TET、HDAC、HMT与HDM等均被证明参与了重编程过程。利用该模型，研究者发现DNA甲基化抑制剂或是调低DNMT1、DNMT3A及识别子MeCP2都可以帮助体细胞向i PSC重编程。同样，抑制HDAC也能够加速重编程的过程。相反，羟甲基化酶TET2对于重编程序过程非常重要，敲除降低TET2会影响i PSC克隆形成，TET2不仅能去除体细胞中的高甲基化，hm C更是重编程过程中的重要标记。此外，PRC1和PRC2复合体组分是重编程所必需的，而抑制Suv39H1和Dot1L可促进重编程过程。细胞重编程是细胞水平逆转衰老的一个成功模型，表观遗传因子在这一模型中的诸多功能，提示我们研究表观遗传因子和表观遗传标记有可能为抗衰老分子机制研究提供新的线索。

尽管干细胞治疗前途一片光明，但其广泛的临床应用还存在诸多问题与挑战。例如， i PSC及其他重编程细胞存在发生肿瘤的风险，人类细胞在体外培养过程中动物来源成分掺入的潜在危害，体外培养的细胞不能很好模拟真实器官的3D结构，以及还未完全消除的免疫排斥问题等。

（刁建波　吴飞珍　郭睿　熊莉君　谭理　蓝斐）