决定器官特异性转移的间质细胞衍生因子

◎Bedrich L. Eckhardt，Tracey L. Smith，Robin L. Anderson，Wadih Arap，Renata Pasqualini

获得转移表型是肿瘤发展最致命的特性。继发性肿瘤可损害器官功能，对标准化疗不敏感，最终导致病人死亡。尽管肿瘤进展具有随机性，但肿瘤对转移器官的亲嗜性，即不同类型的肿瘤有向不同器官转移的倾向。高度转移的肿瘤其共同特点是能适应原发部位和远端转移组织的微环境，从而更好地实现转移。实际上，很多调控转移的基因是间质细胞或细胞外基质(ECM)的构成部分，或需要与其相互作用发挥相应的功能［1-4］。肿瘤转移到特定位点的倾向部分受特定的归巢机制所调控，该机制涉及肿瘤细胞和宿主微环境的配体——受体协调相互作用。尽管在肿瘤转移生物学方面的研究取得巨大进展，但并不完全清楚诱导这些进程的分子机制。

组合性噬菌体展示文库是一个有力的筛选工具，它很容易鉴定到体内相互作用的功能性蛋白。文库的应用揭示了基质微环境尤其是脉管系统——单个器官包含的特定“分子地址”，其在炎症、肿瘤生长和转移过程中被调控［3，5-7］。这一章探讨肿瘤转移进程中间质的作用，重点是利用噬菌体展示技术发现新的破坏肿瘤进程和转移的内皮标记。

3.3.1 定向转移

转移的过程并不是随机的。尽管推测肿瘤转移灶是肿瘤细胞随着血流运动，从原发灶到最先达到的毛细血管［8］，但这个推测并不适用于所有肿瘤。例如，晚期结肠癌病人肝转移的高发病率是由于血流直接通过肝门静脉流动，乳腺癌容易转移至肝而非脾或胃肠道器官［9，10］。此外，尽管肺是乳腺癌和前列腺癌侵入体循环的癌细胞最先到达的部位，但这些肿瘤更容易引起骨转移［9］。

Paget在1889年提出一个替代假说［10］，他对大量乳腺癌病例的解剖数据进行系统的总结，注意到不能用单一的机制来解释转移模型。因而，经过深思熟虑，他提出肿瘤细胞就像一粒种子，它只会在合适的土壤(继发位点)上生长(转移)。尽管这个假说要追溯到一个世纪前，但仍然经得起考验，现在的基因组平台依然支持Paget的假说。事实上，将转移动物模型与基因表达芯片［11］、sh RNA文库［12］、mi R文库［13］和噬菌体组合文库［14］等基因组筛选平台相结合，能有效地鉴定控制肿瘤转移潜能和肿瘤细胞定向克隆定居的关键遗传因素。

基因组筛选的经验也提出来自肿瘤细胞［15］和基质成分［16，17］的因素都可影响肿瘤是否能完全转移。调控转移进程的细胞小室包括内皮［4］、游离的免疫调节细胞［3，18，19］、脂细胞［20］、成纤维细胞［21］和新的间充质干细胞［22］。同样，细胞外基质的非细胞组分提供了一个可选的基质环境，包含影响肿瘤转移过程的调控元件［1，23］。因此，更好地阐述肿瘤进程中细胞与细胞、细胞与细胞外间质以及细胞外间质与细胞外间质间功能性的交互作用，将有利于发展新的治疗方法。

3.3.2 转移过程中间质与肿瘤细胞的相互作用

作为转移过程的前奏，原发瘤细胞外间质逐渐成为一个不稳定的微生态系统，通过它，癌细胞与间质之间的“外部引用”(out-of-context)细胞和非细胞的交流导致了病理性进展［24，25］(图3-5)。尽管致癌性转化导致了最初的细胞生长失控，但这确实需要在一个动态的并对恶性生长需求作出反应的环境中。“饥饿”肿瘤细胞因低效能量应用可导致酸中毒、缺氧和微环境中活性氧的释放，同时这些反应启动一些促血管生成肽的释放，如血管生成素［26］、ephrin A1蛋白、成纤维细胞生长因子-3(FGF-3)和血管内皮生长因子(VEGF)［28，29］，这些分子会诱导内皮细胞向肿瘤细胞转化、生长以及迁移，试图使这些组织“正常化”。来自肿瘤细胞的持续性血管生长信号的刺激，造成脉管系统的动态平衡被破坏，从而提升一般处于静止状态的脉管系统的活性水平［30］。

图3-5 自发性转移的基质调控

注: 在肿瘤发展过程中，增加的氧化应激活化了应激诱导基因，包括LOX、VEGF和糖调节蛋白78(GRP78)。反过来，它们通过招募静息血管细胞和BMDCs促进血管生成。基膜中ECM蛋白和间质ECM的交联为细胞在肿瘤内、外侵袭和迁移做好准备。血管中的肿瘤细胞通过下调转移抑制基因如caspase-8和Kai-1/CD82逃脱内皮细胞的转移抑制信号。LOX通过与转移前微环境中ECM蛋白交联也参与到构建将来可能转移的位点，转移前微环境有利于肿瘤细胞和循环BMDCs的黏附。在肿瘤细胞还未到达的继发位点开始出现募集的BMDCs，它产生的基质细胞衍生因子-1(SDF-1)趋化梯度有助于肿瘤细胞形成。循环肿瘤细胞随即改变细胞表面受体形状，与继发位点细胞外拓扑结构互补，从而对SDF-1作出反应。肿瘤细胞逃逸了细胞凋亡和坏死机制如整合素介导的死亡(IMD)，形成不利的黏附。

除了提高促进血管生成因子外，血供不足也是许多肿瘤的共同特征［31］。由于新生血管形成速度的滞后以及随着肿瘤扩大，血管空间逐渐缩小，导致整个肿瘤局部缺氧［31］。另外，来自于血管生成环境大量的信号导致毫无秩序的脉管系统，其中包括不成熟的、不完善的血管内皮［32］。刚刚发育的血管内皮往往都是极易渗透的，并且血流缓慢，这为肿瘤细胞从血管外渗提供了有利的互动环境。

同时，持续的缺氧使骨髓来源细胞(BMDCs)向肿瘤内聚集以试图恢复血管功能。然而，似乎BMDCs(来自于CD11b+谱系)可以通过很多机制加快肿瘤进展:它们能够整合生长中的血管内皮，从而进一步促进肿瘤血管形成［18，33］、活化ECM中处于休眠状态的蛋白酶类［3］以及抑制T细胞和NK细胞的抗癌作用［34］。最近，已经证明缺氧条件下，肿瘤细胞分泌出赖氨酰氧化酶(LOX)，它是细胞外基质中催化胶原与弹性蛋白聚合的酶，可调节组织的强度［35］。这些翻译后修饰增强了基质支架拉伸强度，产生有利于BMDCs与癌细胞黏附和运动的分子通道［36］。此外，在转移细胞到达之前，在远端组织中首先观察到LOX活性，这意味着缺氧导致ECM翻译后修饰在转移微环境形成过程中起着重要作用［3］。确实，体内系统性抑制LOX活性能阻止BMDCs运动和募集到转移前壁龛并抑制自发性的肺转移［3］。总之，这些研究提示ECM重塑在定向转移中起推动作用。因此，我们认为对转移前壁龛的分子拓扑学的进一步认识将有利于肿瘤的预防性治疗。

间质的ECM经过蛋白酶水解和修饰后，提供了一个能触知的网架结构，从而使肿瘤细胞在其上迁移并最终从原发灶扩散。通过细胞表面受体和ECM配体不断地形成和分解，由趋触作用和趋化作用引导的细胞运动得以顺利地进行［37，38］。由ECM介导的细胞运动主要是由细胞黏附蛋白的整合素家族起作用［39］。功能性的整合素受体是两个亚单位形成的异二聚体，分别包含18个a亚基中的一个亚基和8个β亚基中的一个亚基，两者的结合介导了特定的细胞黏附、生存和迁移［39］。

整合素介导的肿瘤侵袭和转移到达含有丰富配体的远端部位［40］，如整合素αvβ3和α8β1阳性的癌细胞经常转移至肺、骨骼和肾，这是由于ECM同源组分如层粘连蛋白-511、骨桥蛋白(OPN)和肾连蛋白(nephronectin)都位于这些器官中［1，41，42］。相反，缺少有利的ECM组分抑制整合素与ECM的联接，导致了caspase-8依赖的细胞凋亡，这种现象也被称为整合素介导的细胞死亡(IMD)［43］。IMD在正常细胞生物中也可以发生，整合素αvβ3和α5β1阳性的内皮细胞存活和引导作用证实了这一点［43，44］。仅仅只有小部分癌细胞克服了特定的IMD死亡，在外渗过程中存活下来［45］，IMD死亡有可能是发生转移细胞的主要障碍。2006年，Stupack等证明在人神经母细胞瘤中，caspase-8(但不是其他的caspases)表达的缺失使得细胞逐渐抗拒那些在原发灶间质内产生的IMD信号，并具有自发转移的潜能［2］。

特异性内皮细胞表面蛋白也能调控原发瘤转移倾向。2006年，Bandyopadhyay等发现内皮细胞表面趋化因子受体(DARC)Duffy抗原功能性地与Kai-1相互作用，Kai-1是在低转移潜能的前列腺癌细胞表面发现的一种转移抑制蛋白。Kai-1和DARC在血管内相互作用会使得癌细胞衰老，相反不表达Kai-1的细胞则不会停止生长［4］。而且，将Kai-1阳性的肿瘤移植到DARC基因敲除的小鼠中，肿瘤细胞能够逃逸内皮细胞诱导的衰老，进入循环系统，转移至肺中［46］。

肿瘤细胞一旦进入循环系统，与整个机体是分隔的。肿瘤细胞最初由血流引导，但基于分子的互补性和生长信号，最终逸出并定居到远端组织。远端的毛细血管网结构——包括内皮细胞的收缩、亚内皮层的暴露和破碎的基底层——为肿瘤细胞的立足和转移克隆定居提供了有利的微环境。而且在转移过程中，肿瘤细胞能够与血小板和其他循环细胞形成聚合物以抵抗剪切流的压力，增加它们停留在微血管的机会，并提高对趋化性梯度的反应。

2001年Muller等认为癌细胞的扩散类似于白细胞的运输，来自于远端器官的趋化性梯度使得转移出现位点特异性。事实上已经证明，表达趋化因子受体CXCR4的乳腺癌和前列腺癌细胞能够特异性地归巢在肺、骨骼的血管床，正是由于这些器官中SDF-1/CXCL12的趋化性梯度［47，48］。在癌细胞扩散的同时，血管来源的SDF-1可活化VCAM-1，或α5、αv和β3整合素受体也可增加癌细胞黏附在外来的血管内皮，侵入到间质的ECM［49，50］。一旦进入继发部位，肿瘤细胞可能在很长一段时间内休眠，以适应新的微环境，避免对它们有害的细胞毒素，直到最终重建增殖机制，完成可见的转移。

总体来说，在转移的整个进程中，没有哪一步肿瘤细胞在功能上是不依赖于间质的。必须利用体内模型评估转移研究，才能得到疾病发展过程中的各种变化。在这里我们已经阐述了间质如何与一个正在生长的肿瘤相互作用以调整其本身及远处微环境，从而有利于肿瘤的进展。尽管还有许多机制我们尚不清楚，这些反应性微环境的特征将有利于靶向治疗的发展。

3.3.3 噬菌体展示技术:一个鉴定配体-受体相互作用的有效手段

基因组筛选技术已经鉴定了上百个候选转移调控基因。然而，对于它们的功能或者临床转化前景仍知之甚少。而且，高通量测序和基因芯片方法并不能发现间质ECM的分子异质性和翻译后修饰。ECM是控制转移过程中关键的非细胞组分。由此，能够在细胞外空间鉴定生物学上相关的、功能上相互作用的谱型分析技术，在靶向诊断和治疗策略的设计上具有很大的优势。

噬菌体展示技术提供了一个快速、无监督的方法来选择、分离及描述蛋白与蛋白相互作用特征(图3-6)。这个方法以往都被用来指纹鉴定抗体［51］以及在体外和体内识别细胞表面受体-配体复合物［52-54］。组合的噬菌体展示文库包括109独特的循环多肽序列，在每一个独立的丝状噬菌体PIII外壳蛋白上表达一个肽［55，56］。通过蛋白质与蛋白质互补结合，噬菌体会被其靶蛋白捕获并能够重新组装，而多肽通过DNA测序得以鉴定。在每一个精选的文库中，通过对同一样本连续几轮的生物淘选，能够去除非特异性结合的目标。

图3-6 噬菌体生物淘选细胞外靶标

注: 组合的噬菌体展示文库通过尾静脉注射到循环系统。文库中的单个噬菌体被动地分布在寄居点，在那里产生互补性的蛋白-蛋白的相互作用。然后除去器官或大量的细胞，从中分离噬菌体和DNA测序。经过重复淘选，能够选择性富集特异结合的噬菌体。

噬菌体展示技术的一个最大优点是能够在体外设置中鉴定生理上相关的受体-配体相互作用。当从静脉注射时，组合的噬菌体库进行循环，并在不同的器官中得以组装。通过这个方法，我们和其他研究小组已经鉴定了一个组织间独特的血管“地址系统”［6，54］，它在组织之间是独一无二的，并在肿瘤进展中会改变［57-59］。而且，以这种方法鉴定的肽能够将血管生成复合物靶向输送到肿瘤内皮［60］和相关的淋巴管［61］，这也验证了体内噬菌体展示技术的功能和临床应用。

噬菌体展示和转移动物模型这两种方法相结合，为系统地鉴定参与转移进程的肽提供了一个理想的策略。实际上，已经确定了几个靶分子(表3-3)。在后述中，将在功能上验证几个不同的噬菌体展示方法学鉴定的靶标。

表3-3 利用组合噬菌体文库技术鉴定的功能性相互作用的肽

(1) 异黏蛋白

异黏蛋白(metadherin，MTDH)编码了一种跨膜蛋白，它参与细胞间黏附，最近被确定为乳腺癌不良预后的分子标记。2004年，Brown等利用高转移潜能的小鼠乳腺细胞系4T1，创建了包括分泌和跨膜蛋白的噬菌体表达文库，这个文库随后在体内筛选以鉴定那些特异性归巢到肺的特异蛋白，MTDH是以这种方法鉴定的第一个候选蛋白［14］。与对照相比，结合在肺的内皮上展示的MTDH肽的噬菌体提高了20倍，相反在4T1细胞表面能检测到MTDH蛋白，这说明在体内发生了这种相互作用。利用si RNA干扰MTDH基因，或MTDH中和抗体处理，大大地抑制了4T1细胞在肺内克隆定居，也证明了这一点［14］。

最近，Kang实验室研究已经发现8q22的染色体基因扩增可导致乳腺癌细胞MTDH上调［62］。与2004年Brown结果相似，人乳腺癌细胞MDA-MB-231中MTDH下调可抑制肺转移，但不影响脑转移或骨转移。这显示在整个转移进程中MTDH的定向转移作用［62］。而且，已经证明MTDH可介导乳腺癌细胞的化疗耐受［62］，如果癌细胞与内皮细胞共培养，这个结果将进一步增强。总之，MTDH是晚期肿瘤的理想靶点，尽管这个还是新的蛋白特性亟待解决。

(2) 整合素αν

在黑色素瘤小鼠模型中，包含Arg-Gly-Asp(RGD)噬菌体展示肽(RGD-4C噬菌体)高度特异性地结合整合素ανβ3和ανβ5［63，64］。相对于不含肿瘤组织的脉管系统或包含RGD其他基序噬菌体展示肽，RGD-4C噬菌体则特异性归巢肿瘤相关的内皮［64］。这个发现与之前研究整合素αν在肿瘤血管系统中活化的观点相一致［65］。由于RGD-4C噬菌体具有更高的靶向性，采用多柔比星与模拟肽相结合以评估在肿瘤动物模型中针对整合素αν靶向治疗的可行性。与非靶向或未结合多柔比星相比，同等剂量下，多柔比星-RGD-4C靶向治疗具有较低的毒性、诱导血管死亡、抑制肿瘤生长以及抑制肿瘤转移至淋巴结和肺［66］。而且，αν特异性中和抗体能够抑制整合素αν阳性黑色素瘤移植瘤模型的生长和转移，但对整合素αν阴性黑色素瘤移植瘤模型的生长和转移没有影响［67］。这些研究验证了在晚期转移病人的Ⅱ期临床试验中，针对整合素αν，可以和一些化合物包括人源单克隆抗体和寡氨基酸肽结合开展靶向治疗的策略。

(3) GRP78

在一个替选策略中，噬菌体展示技术用来绘制前列腺癌患者中血清来源抗体的差异。在这个技术中，体液免疫反应表现了肿瘤呈递抗原的特征，由噬菌体展示的与这些抗体结合的肽反映了基于肿瘤的抗原［68］。通过这种筛选方法，鉴定的多肽是GRP78模拟物(GRP78是应急诱导因子热休克蛋白70家族的成员)［69］。在酸中毒、葡萄糖饥饿以及缺氧等威胁到破坏内质网正常功能等细胞应急状态情况下，发现GRP78的表达上调［70］。毫无疑问，在静息细胞中GRP78的浓度非常低，但几乎在所有的实体瘤进程中GRP78浓度大幅升高并定位在细胞表面［70-72］。因此， GRP78成为了抗癌、抗转移治疗策略的理想靶标。我们将GRP78 靶向部分 ( WIFOWIQL) 和促凋亡 12-mer D (KLAKKLAK)2进行融合，证明了它能够归巢并抑制DU145前列腺癌移植瘤［73］和4T1.2肿瘤自发的肺、骨转移(未公开的资料)。尽管GRP78对于定向转移并不是一个真正的调节因子，但它在原发灶和继发性肿瘤细胞的表面上调，使其成为一个可行的治疗靶标。

(4) IL-11Rα

IL-11Rα最初在一个病人的器官特异性血管图谱研究项目中被发现，作为与IL-11模拟肽GGRRAGGSC相结合的受体得到验证［55］。IL-11Rα靶向噬菌体特异性结合在正常的前列腺组织，随后的验证发现IL-11Rα表达水平的提高与前列腺癌的恶性及骨转移相关［55，74］。现在其他团队的研究也证实，在骨肿瘤［75］及发生骨转移的肿瘤［15，76，77］中，IL-11/IL-11Rα起着功能性作用。这些数据为骨的晚期肿瘤IL-11Rα靶向治疗提供了强有力的支持。

3.3.4 总结

越来越多的证据表明间质在疾病进程中起重要作用。肿瘤的发生导致局部及远处微环境发炎，改变细胞表面受体展示状态及ECM拓扑结构，以利于转移进程。这里提到了利用噬菌体展示技术如何评价肿瘤分子区域功能的几个例子。利用基因组学的替选方法及进一步的相互交叉验证平台和精简筛选治疗靶标识别了IL-11Rα和MTDH两个候选分子，更加彻底地理解肿瘤和宿主之间的分子相互作用对发展新的治疗策略至关重要。

(董琼珠译，钦伦秀审校)

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