中药血清指纹图谱研究

10.3.1.1　概述

中药传统的口服给药形式决定了中药成分(除肠道直接起作用外)必须先被吸收入血，进入循环系统再到达作用部位才能产生活性。而且，有些成分只有经体内(肠道和肝脏)代谢转化后方能产生活性。中药血清指纹图谱是指将中药经口服给药后一定时间采血，分离血清，经适当处理，采用现代分析技术，得到能够标志该中药药效成分特征的色谱或光谱图。中药血清指纹图谱通过对中药、空白血清、含药血清3组指纹图谱进行比较，得到活性成分在体内的变化情况，为研究中药的物质基础提供信息。中药血清指纹图谱具有能清楚显示中药的药效物质(即血清中移行成分)的优点，将中药血清指纹图谱、中药血清药物化学和中药血清药理学方法结合起来，是研究中药特别是复方中药的物质基础和中药配伍的强有力的工具。因此，中药血清指纹图谱的研究具有重要意义。中药血清指纹图谱的研究方法有高效液相色谱法、液相－质谱联用技术等，其中最为常用的是高效液相色谱法。中药血清指纹图谱的研究内容包括样品处理、色谱条件(或色谱/质谱)条件的建立等等。在血清样品处理时，要注意选择合适的样品处理方法，特别是在样品处理过程中要防止微量成分的丢失，保持血清指纹图谱信息的完整性。样品处理的方便包括蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法。采用蛋白沉淀法时，要避免血清中的药物成分与蛋白共沉淀导致微量成分的丢失。选择色谱条件时，要注意选择合适的色谱条件，以便在指纹图谱中包含尽可能多的色谱峰。选择检测条件时，根据中药所含各类成分的紫外吸收特点，选择合适的检测波长。特别是复方中药，成分复杂，在一个检测波长下得到的血清指纹图谱不能反映该中药吸收入血的成分的全面信息，应在多个检测波长下分别获取血清指纹图谱，对于没有紫外吸收的成分，改用其他检测方法研究其血清指纹图谱。

10.3.1.2　应用实例

实例:基于衰老大鼠模型的银杏叶提取物血清指纹图谱研究

银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，具有抗氧化、改善心脑血管循环、延缓衰老、防治痴呆、提高机体免疫力等多种药理作用。银杏叶含有多种化学成分，其中黄酮类和内酯类化合物为主要有效成分。由于内酯类化合物无共轭双键结构，紫外吸收极弱，难以与黄酮在紫外检测器上同时进行检测。牟玲丽等采用紫外检测器，建立银杏叶提取物黄酮类成分的HPLC－UV指纹图谱。

(1)动物分组及给药。大鼠随机分为模型组、给药组和空白组，模型组大鼠ip D－半乳糖125 mg·kg－1，每日1次，连续42 d，同时ig给予生理盐水10 mL·kg－1。给药组ip D－半乳糖的同时，每天ig给予银杏叶提取物的生理盐水混悬液250 mg·kg－1。空白组分别ip及ig相同体积的生理盐水。各组大鼠于末次给药后2 h眼眶静脉采血，血液置离心管中4000 r·min－1离心10 min，分离血清。

(2)血清样品制备。取血清2 mL，加入乙腈6 mL，快速涡旋1 min，5 000 r·min－1离心10 min，上清液挥干后，用0.1 mL乙腈溶解，12 000 r·min－1离心10 min，上清液供HPLC－UV分析。

(3)对照溶液配制。称取银杏叶提取物和芦丁对照品适量，加甲醇分别配制成1 g·L－1、50 mg·L－1溶液。吸取银杏叶提取物溶液50μL，加入至2 mL空白血清中，再加入乙腈6 mL，按照“血清样品制备”项下方法制备供试品溶液。

(4)色谱条件。色谱柱为Lichrosphere C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm，美国Phenomenex公司);流动相为0.5%甲酸水溶液(A)－乙腈(B)，梯度洗脱:0～30 min，15%～24%B;30～40 min，24%～30%B;40～50 min，30%～80%B;50～60 min，80%B;检测波长350 nm;流速1.0 mL·min－1;柱温30℃，进样量为10μL，分析时间为60 min。

(5)方法学考察。吸取1 g·L－1的银杏叶提取物溶液，按上述方法平行制备5份供试品溶液，分别进样测定指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，考察方法的重现性。另吸取同一份银杏叶提取物供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h连续进样5次，测定指纹图谱，考察方法的稳定性及精密度。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于5%，说明方法稳定可靠。

(6)指纹图谱。HPLC－UV指纹图谱见图10－22。其中，银杏叶提取物对照图谱标定了16个指纹峰，6号峰为芦丁。含药血清标定了10个指纹峰，整体轮廓与体外对照图谱差异较大，说明大多黄酮类成分在体内已代谢。模型组血清与空白血清比较，发现图谱基本一致，仅在6号峰(tR=16.8 min)相应位置处多一小峰，可能为造模后产生的内源性物质。

图10－22　银杏叶提取物的HPLC－UV血清指纹图谱

(a)银杏叶提取物对照指纹图谱;(b)血清指纹图谱
(A－给药组;B－空白组;C－模型组);6－芦丁

银杏叶提取物含药血清与模型组血清及对照指纹图谱比较，发现给药后10种血中移行成分中，12号、13号峰与对照图谱相对应，应为原型成分，但在体内其量甚微;2号、3号、5号、7号、18号峰在模型组血清色谱图及对照色谱图中均未出现，推测为代谢产物;6号峰在模型组血清图谱中相应位置亦出峰，因此不能断定是芦丁还是内源性物质，亦或是两者叠加;15号峰在模型组血清图谱中虽有出峰，然而在含药血清中其峰高远大于模型组血清，因而推测15号峰为代谢产物和内源性物质的叠加;19号峰在对照及空白、模型组血清中均出现，因而不能断定其来源。