免疫组织化学染色方法很多,各有优点和局限性。直接法用酶(或荧光)标记的特异性抗体直接与标本中待测抗原结合,再与底物结合产生有色沉淀,可对抗原进行定位、定性及定量。该方法简便、快速、特异性强,非特异性背景反应低,常用于肾活检及系统性红斑狼疮及其他结缔组织疾病标本的IgG、Ig A、Ig M、C3和C4检查。然而,其检测灵敏度较低,且每种一抗都需单独标记,难以被广泛应用。间接法将标记物与二抗结合,而且一个二抗分子可携带多个标记分子,在二抗与结合了待测抗原的一抗反应后,能结合更多底物,从而将待测抗原信号放大,使反应的灵敏度增加。目前,常用的多是间接法,如ABC法、SP法、Envision法等。
(一)ABC法
1.概述 ABC法是卵白素-生物素-过氧化物酶复合物的简称,其原理是利用卵白素连接在第二抗体和过氧化物酶标记的生物素。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上,再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的卵白素蛋白反应而制备,最后进行显色反应(见图6-2)。
2.试剂配制 一般试剂盒包括:生物素标记第二抗体、卵白素、生物素化过氧化物酶连接物。临用前30min配制ABC复合物:卵白素和生物素化过氧化物酶等比例混合,并稀释成1∶100。
3.操作程序
(1)~(8)同免疫组织化学一般操作程序(1)~(8)。
(9)滴加生物素标记第二抗体,标本置于湿盒,室温温育15~60min。
(10)同免疫组织化学一般操作程序(10)。
(11)滴加ABC复合物(用前30min配),标本置于湿盒,室温温育15~60min。
(12)~(17)同免疫组织化学一般操作程序(12)~(17)。
(二)SP法
1.概述 SP法是链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法的简称,其原理是将生物素标记的第二抗体与SP复合物连接,再与已结合的第一抗体反应,最后用底物显色剂显色(见图6-2)。
2.试剂盒 一般试剂盒包括:生物素标记第二抗体,SP复合物。
3.操作程序
(1)~(8)同免疫组织化学一般操作程序(1)~(8)。
(9)滴加生物素标记第二抗体,标本置于湿盒,室温温育10min。
(10)同免疫组织化学一般操作程序(10)。
(11)滴加SP复合物,标本置于湿盒,室温温育10min。
(12)~(17)同免疫组织化学一般操作程序(12)~(17)。
说明:近年来新出了SP二步法免疫组织化学检测试剂盒,即将SP试剂盒中生物素标记的第二抗体与SP复合物连接制成生物素-SP标记的第二抗体,实验操作时直接滴加生物素-SP标记的第二抗体,省去了(11)、(12)两个步骤,使免疫组织化学操作由传统的三步法(一抗-二抗-酶)变为两步法(一抗-二抗)。此法既能保持原有方法的特异性、敏感性,又能缩短染色时间。
(三)Envision法
1.概述 将第二抗体与酶分子结合于人体内不存在的多聚糖骨架,并螯合了大量的酶分子,再与已结合的第一抗体反应,最后与底物显色剂显色(见图6-2)。
2.试剂盒 包括:Envision酶标记复合物(辣根过氧化物酶聚合物连接的第二抗体)。
3.操作程序
(1)~(8)同免疫组织化学一般操作程序(1)~(8)。
(9)滴加Envision酶标记复合物,标本置于湿盒,37℃温育30min。
(10)同免疫组织化学一般操作程序(10)~(17)。
4.说明
(1)此方法能够聚合多个酶分子使抗原-抗体复合物检测信号显著放大,且多聚糖骨架在人体内不存在,没有非特异性染色,背景干净,实验操作也从传统的三步法简化为两步法,染色时间缩短,但试剂盒价格较贵。
(2)以上提到的室温均指23~27℃,低于此温度可适当延长温育时间。
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