染液的配制

(一)苏木素染液

配制苏木素染液方法有多种,配制的染液各有特点。

1.哈瑞斯(Harris)苏木素液 Harris苏木素液是最常用的苏木素液,其配方为:苏木素1g,无水乙醇10ml,硫酸铝钾(钾明矾)20g,蒸馏水200ml,氧化汞0.5g与冰醋酸8ml。配制步骤如下。

(1)先将苏木素加入无水乙醇,加热溶解,备用。

(2)把硫酸铝钾和蒸馏水放入500ml三角烧瓶加热搅拌,待硫酸铝钾全部溶解,缓慢加入备用的苏木素乙醇溶液,用玻璃棒搅拌煮沸1min。

(3)稍冷却后,慢慢加入红色氧化汞,边加边搅拌,全部加入后,小火继续加热沸腾片刻(此时有大量气泡产生,故容器宜大,以防液体溢出),当溶液变为紫红色时,容器立即移至冰水或流动冷水,缓缓连续摇动,使其迅速冷却,终止氧化。

(4)室温静置一夜后,过滤待用。用前每100ml染液加入冰醋酸5ml(不能在过滤前加入冰醋酸,因为醋酸会使滤纸中的纤维膨胀,使溶液不易通过,导致过滤速度过慢)。如配好后的放置时间较长,冰醋酸可适当多加。冰醋酸量直接影响苏木素的着色能力和清晰度,少了,会造成核浆共染,背景不干净;多了,核着色能力下降。

该染液染色时间为3~10min,可保存1年左右。

该苏木素液使用一段时间后,其表面会产生金属膜,可用粗滤纸捞去,否则贴于切片较难除去。如不急用,可不用氧化汞氧化,苏木素自然氧化一般需3个月左右,用前过滤加冰醋酸。这种染液的使用时间较长。

2.Mayer苏木素液 主要应用于骨组织及免疫组织化学染色,配制方法有2种。

(1)常规Mayer苏木素液:配方为苏木素0.5g,硫酸铝钾25g,碘酸钠0.1g,水合氯醛25g,枸橼酸(柠檬酸)0.5g与蒸馏水500ml。配制时先将苏木素加入煮沸的蒸馏水,充分搅拌使之溶解,依次加入钾明矾、碘酸钠,全部溶解后再加入水合氯醛和枸橼酸,加热煮沸5min,冷却后过滤,染液呈紫红色。

(2)改良Mayer苏木素液:配方及配制方法如下。将A液(苏木素2g加入无水乙醇40ml,加热溶解)与B液(硫酸铝钾100g加入蒸馏水600ml稍加热溶解)混合煮沸2min,用蒸馏水补足600ml,加碘酸钠400mg充分混匀,染液呈紫红色;染色时间为10~20min,不需分化,充分水洗后细胞核显示非常细致清晰的蓝色,常用于对比染色。

3.埃利希(Ehrlich)苏木素液 主要应用一般染色及黏液、骨染色。

(1)配方:苏木素2g、无水乙醇100ml、甘油100ml、蒸馏水100ml、冰醋酸10ml与硫酸铝钾15g。

(2)配制方法:将苏木素溶于无水乙醇再加入甘油,将硫酸铝钾溶于蒸馏水,然后将两液混合,加入冰醋酸,充分混合后置于开口瓶,以纱布或棉花封盖,置于日光下,经常开启封盖、摇匀,经2~3个月自然氧化成熟,颜色变成褐色,过滤后即可使用。该液储存愈久染色力愈强(可保持数年之久),染色时间为10~20min。该染液对经过含酸固定液、脱钙液或长期在福尔马林固定液中保存的组织染色较好,但对冷冻切片染色欠佳。

4.Gill改良苏木素液 该染液不会产生苏木素结晶沉淀,也很少有氧化膜形成,可不用分化,是进行性染色的配方,特别适用于染色质的染色。

(1)配方:苏木素2g,无水乙醇250ml,硫酸铝17.6g,蒸馏水750ml,碘酸钠0.2g,冰醋酸20ml。

(2)配制步骤:将苏木素溶于无水乙醇,硫酸铝溶于蒸馏水,将两液混合后加入碘酸钠,最后加入冰醋酸;此配方为半氧化苏木素液,碘酸钠为氧化剂,硫酸铝为媒染剂,染色时间为5min。

(二)伊红液

1.浓度0.5%~1%乙醇伊红液

(1)配方:醇溶性伊红0.5g,95%乙醇100ml。

(2)配制步骤:将醇溶性伊红溶解于乙醇,然后每100ml加冰醋酸1滴。该染液染色后,不能水洗,必须直接用85%乙醇脱水。

2.浓度0.5%~1%水溶性伊红液

(1)配方:伊红Y0.5~1g,蒸馏水100ml。

(2)配制步骤:将水溶性伊红加入蒸馏水,用玻璃棒搅起泡沫后过滤,每100ml加冰醋酸1滴。

注:实践中水溶性伊红用低浓度乙醇来配制,只要配制得当,其染色效果也会非常好。

(1)配方:伊红Y1g,70%~75%乙醇100ml。

(2)配制步骤:将伊红Y用蒸馏水(少许)调成浆糊状,加入乙醇,边加边搅拌,直到彻底溶解,此时试剂有些浑浊,加入少许冰醋酸,试剂逐渐转变为鲜红色清澈透明,备用。

(三)分化液

在退行性染色中,把附着在细胞、组织上多余的染色剂脱去,从而使目的物与周围组织形成鲜明的对比,同时也使得目的物本身的色泽深浅适当。这种选择性地除去部分染色剂的过程称为分化,用于分化的溶液称为分化液或分化剂。最常用的分化液是1%盐酸乙醇溶液,其配方为浓盐酸1ml加入70%乙醇99ml。用一段时间后该液的分化能力会减弱,需延长分化时间或更换液体。

(四)返蓝液

分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态呈红色;在碱性条件下处于蓝色离子状态呈蓝色。所以分化之后要用水洗去酸,中止分化,再用弱碱性水使染到细胞核上的苏木素变蓝,这一过程称蓝化(返蓝)。返蓝液最常用的是氢氧化氨液,也可用自来水或温水(50℃温水最佳)浸洗返蓝。氢氧化氨液的配制方法是将浓氨水1ml加入蒸馏水99ml。