血浆凝固酶试验

【目的】掌握血浆凝固酶试验,帮助鉴定和鉴别致病性葡萄球菌。

【标本】待测菌株、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌。

【试剂】新鲜兔血浆、0.9%生理盐水。

【器材】Ⅱ级生物安全柜、培养箱、红外线灭菌器、接种环、载玻片、小试管(13mm×100mm)、37℃水浴箱、火柴等。

【操作步骤】

1.操作前准备　戴口罩、帽子、手套,穿工作服,准备并清点本试验所需器材。

2.玻片法　取1滴生理盐水滴于洁净的载玻片上,用接种环挑取待检菌一环于生理盐水中,制成浓的菌悬液,若经10～20s未发现自凝现象,然后加一环家兔血浆混合,10s内观察结果,出现明显细菌凝块为阳性,否则为阴性。试验应同时作阳性(金黄色葡萄球菌)、阴性(表皮葡萄球菌)对照。

3.试管法　用生理盐水将兔血浆4倍稀释后取0.5ml于小试管中,然后挑取3～5个菌落于稀释的血浆中混匀。置37℃水浴箱3～4h后读取结果,试管中血浆凝固呈胶冻状,为血浆凝固酶阳性。若阴性,继续观察至24h,试管中血浆不凝固而呈流动状则为阴性,实验应同时作阳性(金黄色葡萄球菌)、阴性(表皮葡萄球菌)对照。

4.其他　操作后正确处理医疗垃圾,实验器材归回原位。

【注意事项】

1.整个操作过程须注意无菌操作和生物安全防护。

2.应在Ⅱ级生物安全柜中进行,使用红外线灭菌器对接种环灭菌。

3.凝固酶试验玻片法为筛选试验,为进一步确诊需采用试管法测定。凝固酶试验玻片法结果应在10s内观察,菌悬液要浓,血浆最好用无菌新鲜血浆(最好采用EDTA抗凝的兔血浆)。不可用高盐培养基上的菌落进行,因它可出现自凝或假阳性。菌落应新鲜(因陈旧培养物或生长不良菌因凝固酶活性低而变为阴性)。

4.凝固酶试验试管法观察结果时应轻轻倾斜试管,以判定是否有凝块,不要振动试管,以防凝固初期的凝块被破坏。孵育的前4h,应每30min观察1次。因为有些金黄色葡萄球菌能产生大量纤维蛋白溶酶,使凝块过早溶解或在孵育早期出现小凝块而后却被溶解。阴性者继续孵育至24h,因有些金黄色葡萄球菌产生的凝固酶量少,培养24h后才能观察到凝固酶活性。

5.玻片法可作为快速筛选用,而试管法更为准确,所以玻片法阴性或迟凝固时需用试管法证实。

【技能要点】

1.熟练掌握玻片法凝固酶试验,正确判断是否存在结合凝固酶。

2.熟练掌握试管法凝固酶试验,正确判断是否存在游离凝固酶。

(张金艳　郭映辉)