色谱分析样品前处理的方法

（一）高效液相色谱分析方法的确证

1．分析方法的类型　高效液相色谱在医药领域中的应用非常广泛，它能用于化学合成药物的含量测定和杂质限度检查，用于中草药和中成药的定性鉴别和有效成分或指标成分的测定，也能用于制剂分析，如固体制剂的溶出度测定和各种药物制剂的生物利用度测定，还能用于药物代谢和动力学研究。此外，HPLC还广泛用于药物尤其是天然药物有效成分的分离制备和纯化。这些分析方法大致可以分为：①定性分析即定性鉴别，其中既包括有效成分或主要成分的定性鉴别，也包括杂质的鉴别，在体内药物分析中还包括各种代谢产物的鉴别；②定量分析，这包括上述各种组分的定量测定；③杂质限度试验。

2．参数及其确证　对于任何分析方法都必须进行确证（validation）或评价，下文将结合HPLC的特殊性介绍分析方法参数的论证。

（1）专一性（specificity）：专一性又称为特效性，有时也用选择性（selectivity）。专一性是指在可能存在诸多干扰组分时方法明确确定被分析组分的能力，干扰组分包括合成前体、杂质、赋形剂、降解物和基质等。分析含有和不含有干扰组分的样品，比较分析结果，其差异即是方法偏差（bias）。如果结果没有差异，则说明方法具有专一性。对于干扰组分未知的样品，可将结果与已有的确定方法所得结果进行比较。

HPLC方法的专一性可以通过检查色谱峰纯度来确证。采用多波长紫外检测器时，同时在两个波长下检测色谱峰，如果测得该峰在两波长处的吸收之比值恒定不变，则该峰为纯组分色谱峰。用光电二极管阵列检测器时，通过比较色谱峰前沿、峰顶及后沿的光谱图就能判别峰的纯度。此外，还可改变色谱条件观察峰的变化情况来检查其纯度，或者收集色谱峰馏分再采用光谱法等进行纯度检查。

（2）准确度（accuracy）：分析方法的准确度表示测得值与真值或认可的参考值之间的一致程度。此外，真实性（trueness）表示一组测量值的平均值与真实值间的差异，偏差（bias）表示多组测量值的平均值与真实值间的差异，偏差是由系统误差引起的。通常用回收率实验来确证准确度。在制剂分析中，分别用赋形剂的上限和下限量，加入已知量（制剂标示量的80%、100%和120%）的对照品，进行测定，测得量与加入量之比则为回收率。生物样品的分析可用3个浓度的QC样品测得的相对误差来表示。

方法回收率实验应包括整个操作过程，实际上是以相同的方法配制和分析对照品系列和测试样品，以对照品结果绘制标准（工作）曲线，再以此曲线确定样品的浓度。这样，方法回收率总是在100%左右。有的方法只报道预处理（提取）过程的回收率，这反映样品预处理过程中组分丢失的情况，这种回收率一般低于100%，但重要的是要重现性好，即使其值在70%左右甚至更低，方法也仍然可用。

（3）精密度（precision）：分析方法的精密度表示在规定条件下对同一均匀样品多次测得的一组测得值之间的一致程度。精密度的表示方法有标准差、方差，更多的是相对标准差（RSD），美国FDA又把精密度分为重复性（repeatability）、中间精密度（intermediate precision）和重现性（reproducibility），也有人把后两者统称为重现性。重复性表示在相同条件下，短时间间隔内的一致程度，如日内精密度（intra-day precision）和批内精密度（intra-assay或intra-run precision）；中间精密度表示同一实验室内不同日期（inter-day）、不同实验批（inter-assay）、不同分析者、不同仪器间的一致程度。重现性是不同实验室间的一致程度。

在HPLC分析中，如果只用对照品（或样品）溶液重复进样测定精密度，这只表示色谱系统的精密度。而方法的精密度的确证应该对均一的真实（QC）样品进行包括样品处理在内的全过程操作，用接近最低、中间和最高浓度的三个样品浓度进行随机分析。日间精密度还应连续测定8d，每个样品每天至少测定2次。

（4）线性（linearity）和线性范围（1inear range）：HPLC分析的线性是指峰面积或峰高或组分的峰面积、峰高与内标物峰面积、峰高之比与样品中被测组分的浓度（或量）成正比的性能，常以回归线斜率的方差（variance）来表示。而这一线性的上限和下限浓度（量）的间隔称为线性范围。这些浓度都能以确定的准确度和精密度进行测定。如果直线不经过原点，则应该证明其不影响方法的准确度。也可以接受重现性好的非线性响应曲线。

（5）检测限（1imitof detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）：在样品中能检出的被测组分的最低浓度（量）称为检测限，即产生信号（峰高）为基线噪音标准差k倍时的样品浓度，一般为信噪比（S／N）2∶1或3∶1时的浓度，对其测定的准确度和精密度没有确定的要求。

能以适当准确度和精密度定量测定的样品中组分的最低浓度（量）称为定量限。这对低含量的组分的测定如杂质含量的定量测定和体内代谢物的测定是十分重要的。有人以空白样品的本底的标准差乘以一个因子，常为10，然后再分析数个接近该浓度的样品来确证定量限。在定量分析中，定量限比检测限更重要，但是只有近年来报道的方法才给出定量限。

不同类型的分析方法要确证的参数不同，定性鉴别要求确证方法的专一性，痕量杂质限量只要求专一性和检测限，而定量分析则要确证除检测限以外的所有特性参数。在确证生物分析方法的准确度、精密度等参数时，都应采用质量控制（QC）样品。

3．色谱条件参数和系统适用性试验　一个HPLC系统主要包括色谱柱、流动相及其流速和检测器。描述色谱柱的参数有柱的尺寸（柱长×内径）、固定相的种类、粒径和孔径，因此大部分方法都介绍了这些参数，如《美国药典》和《中国药典》收载的方法。值得注意的是不同公司制造的同类色谱柱（固定相），或同一公司制造的不同批号间都存在差异，因此《英国药典》方法还特别注明了色谱柱的生产公司。流动相的组成及比例是实现分离的重要条件。流动相在使用前均需要经过脱气和滤过，这属于常规操作。色谱分离的温度也十分重要，但是HPLC一般均在室温进行。检测器的类型及工作条件是色谱系统条件的必要组成，检测器的灵敏度可以根据具体情况来调节。

《中国药典》2000年版规定的色谱系统适用性试验包括理论板数（理论塔板数）、分离度、拖尾因子（对称因子）和系统相对标准差的试验、调整。有些还规定了保留时间和保留时间比。所有这些都应达到各品种项下的规定，否则应改变某些条件以达到要求。药典方法的分离度指待定量组分的峰与其他峰或内标峰之间的分离度，除另有规定外，应＞1．5。拖尾因子应在0．95～1．05。或配制相当于80%、100%、120%的对照品和规定量的内标物的三种溶液，分别进样3次，平均校正因子的相对标准偏差应不＞2．0%。系统的相对标准差一般应＜2．0%。如盐酸克林霉素的含量测定规定：理论板数按克林霉素计算，应不低于1　300。克林霉素峰与内标物质峰之间的分离度应不＜5。重复进样，其相对标准差（RSD）应＜2．0%。

（二）定性分析方法

HPLC的定性分析即鉴别试验可以分为色谱鉴别法和非色谱鉴别法，后者又可分为化学鉴别法和光谱鉴别法。

1．色谱鉴别法　是利用色谱定性参数保留时间（或保留体积）对组分进行定性分析，其原理是同一物质在相同色谱条件下保留时间相同。此法只适用于已知范围的未知物，如合成药物的前体或药物的可能代谢产物等。常常采用已知物对照法，即往样品中加入某一纯物质（对照品），混匀进样。对比加入前后的色谱图，若加入后某峰相对增高，则该组分与对照品为同一物质。如前所述，色谱峰纯度很重要，如果峰不纯（即分离度很差），则虽为两种物质也不能分别出来。为了提高鉴别的可靠程度，应改变色谱柱的极性和其他色谱条件，进一步验证。

2．化学鉴别法　是利用专属性化学反应对分离后收集的组分进行定性分析。此法只能鉴别组分属于哪一类化合物。通常是收集色谱馏分，再与官能团分类试剂反应。有关官能团鉴别试剂可查阅有关文献。

3．光谱鉴别法

（1）两谱联用法：当相邻组分的分离度足够大时，以制备HPLC获得纯组分，而后用红外光谱、质谱或核磁共振等分析手段进行定性鉴别。

（2）两谱联用仪：将高效液相色谱仪与光谱仪用界面连成一个整体仪器，实现在线检测，称为两谱联用仪。两谱联用仪能同时给出样品的色谱图和每个组分的光谱图，获得定性、定量分析信息。因此，高效液相色谱－光谱联用仪是当今最重要的分析鉴别方法。重要的两谱联用仪有HPLC-UV、HPLC-FTIR及HPLC-MS等，以HPLC-UV最成功，能给出HPLC-UV三维图，但紫外光谱的定性特征性差。HPLC-FTIR及HPLC-MS的定性鉴定效果都很好。

（三）定量分析方法

HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据是样品组分的量（或浓度）与峰高或峰面积成正比。常用的定量方法有外标法、内标法和内加法。

1．峰高和峰面积　先进的高效液相色谱仪都配有微处理机或电子计算机，自动剖析色谱峰的分离情况和基线漂移的补偿，实现峰高和峰面积测量的全自动化。使用电子数字积分仪也能自动测量峰面积。在不具备这些条件时，可手工测量。

色谱分析过程的许多因素均会引起峰高和峰面积的变化，因而影响定量分析的准确度，一般说来，由于峰高测量受相邻重叠峰的干扰较小，当分离度小或流量波动时，常用峰高定量。痕量分析几乎总是用峰高法，因为痕量分析中准确度非常重要，而高精密度并不太重要。当峰形不正或色谱柱超负荷时，峰高法就会出现较大误差。用峰面积定量受仪器参数如流动相组成、柱温、柱效和柱负荷等变化的影响较小，对不是正态分布的峰形也能得到较好的结果。但是，这个方法的准确度受相邻峰重叠的影响较大。

2．外标法　用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量对比求算试样含量的方法称为外标法。外标法可分为外标工作曲线法、外标一点法及外标两点法等，前两种方法常用。只要待测组分出峰、无干扰、保留时间适宜，即可用外标法进行定量分析。但进样量必须准确，否则定量误差大。在HPLC中，因进样量较大，且用六通阀定量进样，误差相对较小，所以外标法是HPLC常用定量分析方法之一。

（1）外标工作曲线法（简称工作曲线法）：用对照品配制系列浓度的对照品溶液（测定生物样品时用标准生物样品），准确进样，测量峰面积（A）或峰高（h），对浓度C绘制工作曲线，利用此曲线或它的回归方程式计算样品溶液的含量。

A＝a＋bC或h＝a＋bC

式中：a与b分别为截距和直线的斜率。

（2）外标一点法：用一种浓度的对照品溶液对比求算样品含量的方法，称为外标一点法。只有在工作曲线通过原点，即截距为零时，才可用外标一点法进行定量分析，否则需用外标二点法定量。外标一点法的计算公式如下：

C样品＝C对照×A样品／A对照

（4）

式中：C样品与A样品为样品的浓度与峰面积；C对照与A对照分别为对照品的浓度与峰面积。峰形为正常峰时，式中的峰面积A可用峰高h代替。

3．内标法　选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法称为内标法。内标法的关键是选择合适的内标物。内标物应该是样品中不含有的物质；纯度要高；与待测组分有相似的理化性质，因而保留时间与待测组分接近；与样品中各组分能完全分离且不与样品反应。内标法可以分为工作曲线法、内标一点法（内标对比法）、内标二点法及校正因子法等。使用内标法可以抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因带来的定量分析误差。如果在样品预处理前加入内标物，则可抵消（或考察）方法全过程引起的误差。

（1）工作曲线法：内标工作曲线法与外标法相似，只是在各种浓度的对照品溶液中加入相同量的内标物。分别测量i组分与内标物s的峰面积A（或峰高h），以峰面积比Ai／As与Ci绘制工作曲线，或求出回归方程式：

Ai／As＝a＋bCi

将与对照品溶液中相同量的内标物加至样品溶液中，分别测量样品中i组分与内标物峰面积（或峰高），以两者峰面积或峰高之比代入回归方程计算出样品中i组分的含量。

（2）内标对比法：内标对比法只配制一个浓度的对照品溶液，然后在样品与对照品溶液中加入相同量的内标物，分别进样。按下式计算样品浓度：

（Ci）样品＝（Ci）对照

与外标法相似，只有线性关系好且截距为零时才可用内标一点法定量。

（3）内标校正因子法：在HPLC中，等量的不同物质在相同实验条件下在同一检测器上的响应值经常不同，为了校正这种响应的差别，引入了校正因子的概念其定义是：被测组分单位峰面积（或峰高）所相当物质的量与参比物质（内标物）单位峰面积（或峰高）所相当物质的量的比值。这是相对重量校正因子，简称校正因子。HPLC的校正因子很难由手册查到，常常自行测定，其测定方法是配制含有内标物的对照品溶液，在完全相同的实验条件下，进样5～10次，分别测定峰面积，代入下式求各组分的相对重量校正因子。

Fi＝Mi／Ai Ms／ As

式中：Mi与Ms分别为待测组分与内标物的量；Ai与As分别为它们的峰面积。

用内标校正因子法进行定量分析时，准确称取Ms克的内标物，加入样品内混匀，进样，则：

i组分与内标物重量间有下述关系：M×100%

4．内加法　又称叠加法。这种方法是将待测组分i的纯品加至待测样品溶液中，测定增加的溶液比原样品溶液中i组分的峰面积增量，求算i组分的含量。此法不需要内标物，又能克服由于进样量的不准确所带来的定量分析误差。

（四）痕量分析法

痕量分析即痕量组分的分析，通常指含量＜0．01%的组分的分析。在医药领域内经常遇到痕量分析的问题，如药物的痕量杂质或降解物（尤其是有毒物质）和体内药物代谢产物的分析测定。前者的样品量（体积）可能不受限制，而后者则可能只有很小体积的样品，但二者的共同点是待测组分的含量极低，并且含有大量的干扰组分。HPLC能很好地完成痕量分析任务，因为它既有良好如果样品量为M克，则i组分在样品中的百分含量为：Mi＝AiFi的分离性能，又具有高选择性和高灵敏度的检测器。在进行HPLC痕量分析时，需要考虑下列问题和采取相应步骤。

（1）为了减小分离过程中色谱柱内的稀释效应，应尽可能使用细孔径的短柱，并选择适当的色谱条件以获得较小的值，当在0．5～1．5的范围时，稀释效应很小。这也就是越来越多的细孔径柱或微孔径柱用于体内药物分析的原因之一，内径1mm的柱子的稀释效应大约是内径4．6mm的常规分析柱的1／20。在样品体积有限时，这一点尤为重要。

（2）使用传质速率高的细颗粒固定相以提高柱效，这不仅减小稀释效应，适应样品体积小的要求，而且也改善分离效果。这样，在样品极稀但有足够体积时，即使增大进样体积引起峰展宽，或者干扰组分超载也仍然有好的分离度。

（3）当有大量干扰物质共存时，有两种洗脱方法。一种是使大量干扰物质在死时间流出，待测痕量组分稍后流出。另一种是使待测组分在干扰物质之前流出。一般认为前一种方法具有更多的优点，实践中应根据具体情况作出选择。

（4）应当选择灵敏度高、选择性好、噪音低的检测器，在体内药物分析中常用荧光和电化学检测器，它们能检测pg级的痕量组分。许多物质可通过化学衍生化以适应检测的需要。

（5）如果样品极稀，加大进样体积仍不能检测时，就应考虑样品的富集和浓缩。

（6）痕量分析一般采用峰高法定量，因为峰高测量受相邻峰干扰小，结果较准确。但当进样体积很大，柱效下降严重时，应该用峰面积定量。痕量组分可以采用内加法或外标法定量。

（五）药物杂质总量限度测定法

药物中可能存在着各种杂质，有时并不确切知道是什么杂质。《中国药典》规定了杂质（即有关物质）的限量检查，其方法如下：

1．内标法　内标法是将所有杂质峰总面积与内标物峰面积（不加校正因子）相比较，不得超过规定限度。

2．主成分对照法　此法是将各杂质峰面积及其总面积与主成分的峰面积比较。主成分对照法也可使用峰高法。

3．面积归一化法　这里的归一化是把所有峰（溶剂峰不计算在内）的面积之和作为1即100%。限度检查的归一化法是计算各杂质峰面积或其总和占总蜂面积的百分率。

以上三种方法的色谱图的记录时间一般应为内标物或主成分保留时间的2倍，还需要调节检测器的灵敏度或进样量，使峰面积或峰高满足一定的要求。

（六）主要进度

目前，医药分析领域HPLC技术的应用仍在继续扩展，对技术本身的要求也日益提高，从而促进许多HPLC新技术、新方法的开发和完善。医药高效液相色谱技术及其应用的新进展主要包括如下：

1．手性分离技术　据统计，大约有40%的药物为手性化合物。手性药物的两个对映体在药理活性及强度、毒副反应、体内代谢等各方面都可能体现出立体选择性。手性药物的对映体拆分即手性分离（chiral separation）是当今药物分析的前沿课题，而HPLC是对映体分离分析中使用最多、应用最广的技术。各种新型手性固定相的不断涌现，必将大力推进手性药物的深入研究。

2．液相色谱-质谱联用技术　液相色谱－质谱联用技术（LCMS）在选择性、灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究（包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如蛋白异常的研究）。LC-MS已逐渐成为新药研究必不可少的手段。

3．多维HPLC及柱切换技术　高效液相色谱的柱切换技术是通过程序控制的切换阀改变流动相的流向和（或）流动相系统的技术。这一技术在医药分析中的应用越来越多，尤其在体内药物分析中的应用最为广泛。利用柱切换技术可以实现样品的在线净化与富集、在线衍生化、在多个色谱柱上进行分离。其中将保留机制不同的色谱柱组合起来进行的分离成为多维高效液相色谱（multidimensional HPLC）。可以有多种组合的多维HPLC，如分子排阻－反相HPLC、离子交换－反相HPLC、液固－反相HPLC等，特别值得指出的是非手性－手性的联用越来越受到重视。多维HPLC改善了分离效率和选择性，提供了更多、更可靠的定性定量信息，在复杂样品的分析方面有着巨大的潜力。

4．衍生化技术　高效液相色谱的衍生化（derivatization）技术发展十分迅速，已报道有适应多种用途的衍生化技术和试剂，如用于质谱检测的衍生化试剂、胶束介质中的衍生化尤其是固相衍生化和酶反应衍生化，这些技术都具有许多独特的优点。衍生化不仅提高了HPLC分析的灵敏度和选择性，而且大大扩展了HPLC的应用范围。

5．毛细管电色谱技术　毛细管电色谱（capillary electrochromatography，CEC）是最近发展起来的一种高效微分离技术，是电渗流驱动的微柱液相色谱，它属于电分离方法，也有电渗流和压力双重驱动力的电色谱。电色谱具有电泳力和分配作用双重分离机制。毛细管电层析具有高效、高选择性及微量、快速的特点，势必在微量分析中占据重要地位。但毛细管电色谱技术还只处在起步阶段，在医药分析中的应用有待于进一步开发。

除上述几方面外，新型固定相尤其是适合于生物样品分析的固定相的开发、新型检测器的研制等都将进一步推动HPLC在医药分析领域的应用。可以预见，医药高效液相色谱技术必将得到更加迅速的发展和日益广泛的应用。