不同个体同种成分的混合检材

二、不同个体同种成分的混合检材

轮奸案中多个男性的混合精斑、凶杀案中的混合血斑等是由2个或者2个以上个体的同种成分混合后形成的混合斑迹。对这类检材进行STR检测会产生混合DNA分型图谱。应用STR等位基因的峰高和峰面积信息可辨识出不同个体的DNA分型。应用DHPLC技术对混合样品DNA扩增产物分离后也可进行测序。单细胞分离及其DNA分型技术也有望用于解决混合检材的个体识别。

（一）应用荧光STR图谱信息进行混合检材分析

1．STR基因座的信息应用高杂合度的STR基因座数目越多，区分混合检材的不同个体的概率越高。但是，检材中不同个体DNA的比例、DNA模板的总量会影响混合检材的STR分型图谱。对于混合检材来说，低于5%的成分通常不容易被检测到。使用AmpFl STR试剂盒的实验表明，只有DNA模板量大于35 pg的混合成分才可以得出STR基因分型。

2．等位基因荧光峰的信息等位基因荧光峰的信息可用于解释混合检材中可能的基因分型。此时，使用峰面积优于使用峰高。但是使用峰高解释混合检材中的个体成分更简便一些。

Stutter的峰高/峰面积应低于其主等位基因峰高的15%。单一个体的检材中，如果是杂合子，其峰高值往往不相等，峰值较低的等位基因除以峰高较高的等位基因，比率应在0．5至1之间。如果在一些STR基因座中有很多峰都符合这一规律，那么这份检材可能来自2个或更多个体。

3．混合检材基因型的确定下列现象有助于考虑是否为混合检材：①多个基因座有或超过2个等位基因；②在1个基因座内，有明显的杂合子等位基因的峰高不平衡现象；③混合检材通常在1个或更多基因座中存在3个或更多等位基因。

当1份检材的某一STR基因座的分型图谱中有多个等位基因峰发生重叠时，这个等位基因的峰就表现得不合理。例如，2个个体的FGA基因座等位基因分别是23，24和24，24，如果它们是1∶1的混合，则等位基因23∶24峰高将是1∶3。如果没有更多的信息，该检材有可能会被解释为具有高stutter产物的属于单个人的检材。此时，继续检查别的基因座有3个或4个峰（等位基因峰不发生重叠时），这份检材就有可能是混合检材。

4．混合检材STR分型结果的解释确定混合样本的步骤：①确定单个基因座有或超过2个等位基因；②确定来源个体的数目；③确定每个个体成分所占比例；④分析所有可能存在的基因型组合；⑤与参考样本分型进行比较。

（1）先排除下列因素：Stutter产物、无效等位基因、染色体异常（三体综合征）、三等位基因现象和非特异扩增等。

（2）如果发现某个STR基因座的图谱中有多于4个等位基因，则说明其供者可能多于2个个体。值得注意的是，在案件中所遇到的混合检材供者大多是由2个个体组成。

当STR分型图谱中基因座没有等位基因重叠时，混合检材中不同个体成分的比例容易确定。若有等位基因重叠时，混合检材中不同个体成分比例的估计就变得复杂了。

（3）牙釉质基因，对于解释正常情况下的男性和女性个体混合成分是非常有效的。代表混合检材中男性和女性的X和Y染色体等位基因的峰比在表22－3中列出。在决定男性和女性对混合检材谁是主要供者的问题上，牙釉质X和Y峰的面积也是非常有用的。

（4）要考虑每个基因座上所有可能的基因型组合，先要弄清楚混合检材中不同供者成分的比例，确定主要供者和次要供者的基因型。

（5）最后，将混合检材中不同供者成分的STR分型图谱与参照检材的STR分型图谱作比对。在性侵犯案件中，参照检材可能来自嫌疑人，也可能来自受害者，或者两者兼有。如果来自嫌疑人的STR分型图谱和混合检材中主要（或次要）供者的图谱比对上了，那么这个人就不能排除是该混合斑的一个供者。

（6）混合检材中各组分的比例在斑痕的不同位置可能差别很大。这时，可以检测多个部位，观测所有检测结果后，再挑选易于分析的图谱进行解释。

英国法庭科学服务中心的专家建议，如果不是迫不得已，最好不要试图解释混合检材。一些法医实验室已经决定不再试图完美地解释混合检材的基因分型，也不进行主要供者和次要供者的区分。更容易的方法是确定嫌疑人STR分型图谱是否包含在犯罪现场的混合图谱中，如果嫌疑人所有的等位基因都存在于犯罪现场混合检材的STR分型图谱中，那么该嫌疑人就不能被排除是犯罪现场混合检材的提供者。同样，可以把受害者的STR分型图谱从混合检材的图谱中剔除出来，这样就使犯罪者STR分型图谱中的等位基因更容易辨认。

表22－3　牙釉质基因男性和女性的X和Y染色体等位基因的峰比

（二）应用DHPLC技术分析混合检材

变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）技术是一种全新的高通量筛选DNA序列变异的技术。DHPLC可以在3种条件下分离DNA片段。

1．非变性条件依赖于分子质量的分离，见图22－4（彩插）。

2．部分变性条件根据片段序列是否存在差异进行分离，见图22－5（彩插）。

3．完全变性条件根据单链片段大小和序列进行分析。

美国丹佛大学DANIELSON博士在2000年，率先将DHPLC技术应用于法医DNA鉴定，在一些案（事）件的检验中发挥了重要作用。

DHPLC可用于DNA样本的两两比对。如将现场物证的DNA和嫌疑人或受害人某DNA片段扩增产物混合后，使之变性、复性，再行DHPLC检测，单峰者为同源样本，否则为非同一来源的样本。

对于大规模灾难事件，将现场物证或受害人（或其亲属）样本与参照样本的某DNA片段扩增产物混合后，使之变性、复性，再行DHPLC检测，谱图表现为单峰者为同源样本，否则为非同一来源的样本。

（三）利用单细胞分离技术检验混合检材

（1）利用显微操作分离出单个细胞，可采取以下2种方法。

直接法：在倒置显微镜+显微操纵器下，利用毛细玻璃管提取单个细胞并转移至离心管中。

激光捕获显微分离技术（laser capture microdissection，LCM）：利用激光自动化分离染色固定于涂片上的单个细胞，并自动转移至离心管中。

（2）使用全基因组扩增试剂盒扩增单个细胞的基因组DNA。

全基因组扩增试剂盒利用6碱基随机序列引物扩增全基因组DNA，能将起始样本的量放大1 000倍，使模板DNA由单细胞的皮克级水平增加到纳克级水平，扩增结果保持高度忠实性，完全代表起始样本的信息。模板DNA经全基因组扩增后大部分DNA片段长度大于10 kb。

（3）经过全基因组放大后的单个细胞DNA用优化后的PCR条件进行扩增，如缩短产物长度、调整Taq酶用量、增加循环次数等，可提高扩增效率。也可应用测序分析。

（4）由于精子细胞都是单倍体，因此需要先用X、Y染色体上的STR分型对混合样本中的精子进行分组，一般一个个体取10个细胞为一组。然后再对每组细胞进行常染色体STR分型，获得的单倍体细胞的分型结果进行叠加累计，复原二倍体的STR分型结果。

单细胞分离方法有可能从根本上解决混合斑迹的个体识别难题，提高混合斑检材的利用价值。

（胡　兰　李万水）

参　考　文　献

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