成纤维细胞的衰老与永生化

衰老或称老化（aging，senescence，senility），是生物界的普遍规律。作为生物体的基本单位，细胞也会衰老和死亡。细胞衰老（cell senescence）过程的长短即为细胞寿命（cell lifespan）。细胞寿命因其组织种类的不同而有差异，此外还受环境因素的影响。

一、成纤维细胞的衰老

体外传代培养的细胞经过有限次数的细胞分裂后，出现仅维持基本代谢过程但却因丧失了DNA合成能力及有丝分裂能力而不能继续增殖的现象，称为复制衰老（replicative senescence），也称死亡1期（Mortality stage 1），简称M1期。复制衰老是生物体衰老在细胞水平上的反映。复制衰老现象存在普遍性，体外培养的Fb也不例外。Hayflick早在1961年就发现，人类Fb在体外培养时的分裂次数是有限的。事实上，正常动物的体细胞不论是在体生长或是在体外培养条件下生长，其分裂次数总是有限的。高等动物的体细胞均有其最大分裂次数，各种动物的细胞最大分裂数各不相同。当达到最大分裂次数时，细胞便会衰亡。体外培养的正常体细胞的可传代次数与该种生物寿命的长短和供体年龄的高低有关。细胞的供体年龄越大，其在体外培养时的可传代次数就越少。体外培养细胞的最大分裂次数被称为Hayflick极限。如人胚Fb在体外培养时，只能增殖60～70代；人类体细胞的最大分裂次数一般为50～60次。

细胞的分裂增殖次数与其染色体端粒（telomere）的DNA长度有关。端粒是位于真核生物的染色体末端的特殊结构，由进化上高度保守的DNA重复序列－TTAGGG－组成。端粒对染色体有保护作用，可防止染色体降解或染色体的臂端发生端间融合。人类染色体末端普遍存在端粒结构，不同类型细胞的端粒长度会有所差异，体细胞的端粒比生殖细胞短。Harley等在1991年发现体细胞染色体的端粒DNA会随细胞分裂次数增加而不断缩短。细胞DNA每复制一次，端粒就缩短一段。因此，染色体的端粒有细胞分裂计数器的功能，能记忆细胞分裂的次数。在端粒随细胞分裂而逐渐缩短过程中，端粒缩短达到一定程度即可启动DNA损伤检测点（DNA damage checkpoint），激活与细胞衰老相关的p53信号通路，引起p21表达。人二倍体成纤维细胞染色体端粒的－TTAGGG－重复序列长约4kb，衰老时其端区长度可降至2kb，此时传代培养细胞的分裂达到Hayflick极限，细胞将不再分裂。端粒的长度还与端粒酶（telomerase）的活性有关，端粒酶是催化合成并维持端粒一定序列的核糖核蛋白，由RNA和蛋白组成，具有反转录酶的活性，能以自身RNA为模板合成端粒上高度保守的由－TTAGGG－组成的DNA重复序列。在精原细胞、干细胞和肿瘤细胞中有较高的端粒酶活性，而正常体细胞中端粒酶的活性很低，且多呈抑制状态。总之，端粒消失可能是人类细胞丧失复制能力的原因之一。

体外培养的Fb是常用的细胞衰老研究模型。人类细胞的复制衰老涉及了复杂的分子调控机制，在诱导细胞衰老方面存在着一些起决定性作用的信号通路，代表性的信号通路包括p53信号通路和p16／pRB信号通路，p53和pRB蛋白是两种关键的肿瘤抑制因子。在一些细胞中，端粒异常、DNA损伤及一些致癌基因的表达会通过p53信号通路导致细胞衰老。p53的失活或缺失可延迟、阻断甚至逆转一些细胞的复制衰老。而p16／pRB通路介导的是致癌基因的表达、染色质断裂及多种多样损伤作用引起的“差错”积累而导致的细胞衰老过程。p16基因不仅是细胞衰老遗传调控程序中的主要环节，也会影响细胞寿命与端粒长度。p16是pRB的正向调节分子，它通过正向调节pRB的活性而并非激活端粒酶来发挥诱导细胞衰老的作用。p16基因表达的负调控机制减弱是细胞复制衰老时p16基因高表达的重要原因。

在某些情况下，细胞也可越过前述p53信号通路和p16／pRB信号通路介导的复制衰老（即M1期）而继续增殖，但染色体端粒却继续变短，终致细胞危象（crisis），也称死亡2期（mortality stage 2），简称M2期。M2期是以暴露的染色体末端、末端融合、染色体断裂融合成桥环、有丝分裂灾难（mitotic catastrophe）并出现大量凋亡细胞为特点。

Fb衰老不仅可体现在体外培养时，同样也存在于人类皮肤。在时程老化和（或）光老化的皮肤中，同样也存在着因Fb衰老引发的细胞增殖减弱、胶原等细胞外基质成分合成不足甚至降解增加，导致真皮萎缩。在临床上，一些慢性创面经标准化的治疗后仍难以愈合。近年的研究已注意到Fb衰老在创面慢性化（wound chronicity）中的作用。对正在愈合中创面微环境与无愈合慢性创面的比较研究已发现许多削弱或妨碍愈合的潜在机制，其中的引发机制之一在于，慢性创面中Fb的增殖抑制和持续性炎症下应力诱发的早熟性衰老表型（stress－induced premature senescence phenotype）的诱导，衰老Fb显示了细胞外基质降解表型，从而有助于创面的慢性化。15%衰老Fb的积聚被视为阈值，一旦超出则创面难以愈合。衰老细胞与非衰老细胞的比值是决定创面对治疗措施反应的关键因素，通过增加非衰老细胞而调节该比值的疗法则可能提高创面治愈率。许多组织工程皮肤替代物因含有非衰老的Fb，因此能给创面提供可释放生长因子并逆转慢性创面渗液抗增殖活性的细胞成分。

二、成纤维细胞的永生化

通常情况下，当利用体外培养的正常对照Fb或病变组织Fb进行研究时，从活体组织中取材的组织量不多，研究所需的细胞量也不大，研究的持续时间并不长，研究者也会有意使用早期传代培养的细胞，以免因传代次数过多使得从病变组织衍生的Fb丧失其在组织原位所具有的一些生物学特性或分子变化特点，因此，Fb的复制衰老问题尚不会对研究课题有很大的影响。然而，当因某种特定目的（如制备组织工程皮肤或其他组织工程器官）而需要获得大量体外培养的Fb时，或因某些特定的研究要求而需要在长期研究课题中始终使用分裂增殖特性持续稳定的Fb时，Fb的复制衰老问题就成为明显的制约和限制。此时，研究者反复从活体组织中再分离培养新的Fb，不仅仅是繁琐乏味的工作，实际上也难以达到上面提到的特定目的或特定的研究要求。因此，在这些情况下，研究者迫切需要具有持久分裂增殖能力、能反复传代的永生化成纤维细胞（immortalized fibroblasts or immortal fibroblasts）。所谓永生化（immortalization），是指细胞从复制衰老（M1期）和细胞危象（M2期）中逃逸，从而具有无限增殖能力。

一些细胞在体外培养时很容易适应培养环境，能自然克服复制衰老的限制而永生化，然而，这种自然形成的永生化细胞总是拥有不稳定的基因型并且常常为携带大量突变基因的细胞，难以作为它们最初起源组织表型的可靠代表。因此，理想的永生化方法得到的细胞不但应获得持久的增殖能力，而且还应拥有与原起源组织或细胞相同的表型特征、组织或细胞标记。目前，已建立了一些使细胞永生化的方法有：①病毒转化（viral transformation），包括EB病毒（EBV）、猿病毒40（SV40）T抗原、腺病毒E1A及E1B、人乳头瘤病毒（HPV）E6及E7等在内的病毒基因可凭借病毒转化作用来诱导细胞永生化。多数情况下，这些病毒是通过灭活前面提到的细胞内肿瘤抑制基因（如p53或pRB）而使细胞永生化的。尽管病毒基因诱导永生化的方法可靠且相对简单，但所获得的永生化细胞在遗传学上可能是不稳定的（非整倍体）并可能丧失原有细胞的某些特性。②外源性端粒酶反转录酶的表达，通过使细胞表达端粒酶的催化亚单位——端粒酶反转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）使细胞永生化，这是目前使细胞永生化的最佳方法，尤其适用于那些细胞分裂次数减少与端粒长度渐进性缩短相关的细胞，如人类的多种细胞。人端粒酶反转录酶（hTERT）在人类大多数的体细胞无活性，当外源性hTERT导入细胞并表达后，可维持细胞染色体端粒的长度足以避免细胞的复制衰老，对此种方法所得的永生化细胞分析表明，这些细胞可维持稳定的基因型并能保留关键的表型标记。对分别植入衰老成纤维细胞与永生化成纤维细胞的体外构建人工皮肤的比较研究发现，前者的皮肤脆性增加，表皮下水疱形成，而后者则无表皮下水疱形成现象；DNA微阵列研究也显示衰老成纤维细胞胶原合成减少、与炎症和基质破坏相关的分子标记增加，而永生化成纤维细胞则显示了与早期传代细胞相似的表型。这表明通过使端粒酶表达的永生化方法不但赋予Fb永久复制能力，而且阻止或逆转了在衰老细胞群所呈现的生物学功能的丧失。③其他方法。放射诱导法（X线或Co等）、癌基因或突变的抑癌基因转染法、化学法（使用四硝基喹啉－氧化物或黄曲霉毒素）或几种方法的联合应用等，这些方法常有一些局限性。目前，已有许多诱导细胞永生化的研究报告，并有一些经过充分鉴定并已商品化的永生化细胞系可用于研究。就Fb而言，也有一些商品化的永生化成纤维细胞系可以利用，如ATCC提供的hTERT诱导表达的永生化成纤维细胞系ATCCCRL－4001TM BJ－5ta源于人包皮成纤维细胞。

细胞的永生化（cell immortalization）是生命科学研究的一个重要领域。尽管仍有许多问题尚待阐明，但细胞永生化的重要意义已得到了广泛认同。细胞永生化不但可为细胞生物学的研究提供性状稳定的研究对象，而且可能为组织工程器官的研究及其应用提供丰富的细胞材料，还对肿瘤发生机制研究具有重要的启示作用。就皮肤成纤维细胞而言，成纤维细胞永生化的研究对于为组织工程皮肤中真皮种子细胞提供丰富稳定的来源、为某些皮肤病体内治疗提供稳定载体及深入探讨某些皮肤疾病的发生机制方面同样具有深远的意义。

（何　威）

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