芯片技术在妇科肿瘤早期诊断中的应用

（一）基因芯片技术

1.基因芯片技术的原理　基因芯片又称为DNA芯片，是基于核酸互补杂交原理研制的，通过将大量探针有序的固定在固相基质上，与待测样品按碱基配对原则进行杂交，应用激光共聚焦荧光检测、计算机系统分析，确定样品中的核酸序列和性质，对基因表达的量和特性进行分析。基因芯片技术将微电子技术、固相合成技术、照相平板印刷术、核酸分子杂交技术、激光共聚焦荧光扫描技术、电子计算机分析技术有机结合起来，已成为一种高新生物技术平台。基因芯片技术具有快速、平行、高效、高通量地分析生物信息的特点，通过一次实验能在全基因组范围内同时分析样本中上万个基因的表达及相互调节的关系，获取相当于几十万次传统核酸杂交反应获得的有关基因表达信息，被评为1998年度世界自然科学领域的十大进展之一。根据基因芯片功能的不同，分为基因表达谱芯片、基因测序芯片、基因毒理芯片和基因指纹图谱芯片；根据芯片组成成分分为cDNA芯片和DNA芯片，cDNA芯片则只能用于基因表达谱分析，DNA芯片可以用于基因表达谱分析、基因突变和单核苷酸多态性检测。

2.基因芯片技术的分类及特点　基因芯片技术包括：基因芯片的制作、杂交、检测。目前基因芯片的载体很多，应用最为广泛的是玻片和硅片两种，芯片载体需要进行化学修饰以便寡核苷酸能够固定在介质上，修饰后的芯片载体要求表面均匀硬质、具有低荧光背景、较高的信噪比、各点的变异系数低等。芯片的制作方式主要有：原位光导合成法、分子印章原位合成法、半导体光刻法和合成后微点样制备寡核苷酸芯片法。原位合成法由Affymetrix公司首先开发，该方法的优点合成效率高，点阵密度高，用很少的步骤合成大量的探针，缺点是设备昂贵，技术复杂，合成的寡核苷酸长度较短，一般为20 nt左右，每个基因需使用多个相互重叠的探针片段进行检测才能对基因进行准确鉴定，合成反应每步的产率较低，原位合成法适用于寡核苷酸芯片的制作。点样法常用的打印方式有针式打印法和喷墨打印法两种。针式打印法操作简单，成本低，探针密度高，但定量准确性、重复性不高，打印针使用寿命短；喷墨打印法定量准确，重现性好，使用寿命长，但斑点大、探针密度低。与原位合成法相比，点样法技术简单，易操作，成本低，探针来源灵活，探针长度较长，但点阵密度较低。

芯片杂交是提高芯片应用的准确性的关键步骤，杂交反应受到多因素的影响，如：①寡核昔酸探针密度；②支持介质与杂交序列间的间隔序列长度；③杂交序列长度；④GC含量；⑤探针浓度；⑥核酸二级结构。杂交后的芯片进行放射自显影或用激光共聚焦荧光扫描仪进行扫描（用荧光素标记者）。靶基因与探针严格配对形成的杂交分子热力学稳定性高，发射的荧光强度强，不完全杂交的分子热力学稳定性差，荧光信号弱。荧光强度与靶分子含量呈线性关系，通过电子计算机图像处理软件将图像资料转换成数据资料，进一步进行基因表达谱分析、基因分类、疾病分型、基因突变检测、单核苷酸多态性分析等研究。

3.基因芯片技术在妇科肿瘤早期诊断中的应用　肿瘤的发生是多步骤、多因素的过程，利用基因芯片比较各种基因的表达谱，确定各种基因在表达上的相关性，在全基因组范围内研究肿瘤的发生、发展，筛选肿瘤的早期诊断指标。目前的研究中，应用基因芯片技术检测正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞中mRNA表达的差异，人卵巢癌相关候选基因-4、人类肿瘤相关黏蛋白-1、表皮生长因子受体家族-3、分泌白细胞肽酶抑制因子、肉瘤病毒相关癌基因同源物、B细胞淋巴瘤/白血病相关基因-2、乳腺癌印记基因、G蛋白信号转导调控因子-19等在卵巢癌基因表达上调，通过基因芯片筛选的基因表达产物可能成为卵巢癌的肿瘤早期诊断的标记物。Lee等通过cDNA芯片、半定量RT-PCR，卵巢癌COMT、NLK、HMGI、ErbB-3、ACBP、S100A基因上调，COUP-TFII基因下调，卵巢癌中差异表达基因与葡萄糖/胰岛素代谢有关，葡萄糖/胰岛素信号通道与卵巢癌相关。Huddleston等用cDNA芯片研究45例卵巢癌、49例卵巢良性肿瘤、32例正常卵巢，结果显示CKB在卵巢癌中表达上调，是正常卵巢的18倍；血清CKB活性卵巢癌组为24.7 U/L，卵巢良性肿瘤组为9.6 U/L，正常卵巢组为8.5 U/L，提示CKB为卵巢癌早期诊断的肿瘤标记物。HPV感染与宫颈癌的发生相关性已经得到广泛的共识，建立HPV高危型和低危型检测芯片，通过基因芯片技术进行宫颈癌的普查和随访。Hudelist G等应用芯片技术测定正常宫颈上皮细胞及HPV感染的宫颈癌细胞中基因的表达，显示高危HPV感染的宫颈癌标本中ERBB2、KIT、RAS、MET、FGFR2、STAT1、Bcl-2、细胞结构相关基因等的表达上调，TGF受体、整合素、IL-1、胰岛素样生长因子结合蛋白等家族中部分成员表达下调，提示通过细胞刷获取宫颈细胞，分析基因表达的特点预测宫颈癌的发生。

（二）蛋白质芯片技术

1.蛋白质芯片技术原理　蛋白质组学是在蛋白质水平上动态、整体性的研究生物体生命活动的科学。蛋白质组学不是一个封闭的、概念化、稳定的知识体系，而是旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式的学科领域。蛋白质的表达受到多种因素的调控，生命的不同发育阶段、生命体的不同组织、疾病或治疗过程中细胞内的蛋白质组成及变化都有所不同。研究蛋白质之间相互作用的方法很多，传统方法：ELISA、放射免疫测定、蛋白质印迹等，现代技术：蛋白质芯片技术、二维凝胶电泳和质谱联用技术、高效液相技术等。蛋白质芯片（protein chip）是以蛋白质为检测手段和（或）检测目的的生物芯片的一种。基本原理是将纯化的多肽、蛋白质或其他分子作为探针高密度排列固定于固相支持介质表面而构成微阵列，根据探针物理、化学或生物学特性的不同，选择性地从待测生物样品中捕获蛋白质。经原位清洗除去未与探针结合的分子，再利用各种检测技术定性、定量分析芯片上结合的蛋白质。

2.蛋白质芯片技术的分类及特点　蛋白质芯片的分类：根据芯片用途分为蛋白质功能芯片、蛋白质检测芯片；根据载体的不同分为玻璃芯片、多孔凝胶覆盖芯片、膜芯片、微孔芯片；根据芯片表面的不同化学处理分为化学芯片、生物芯片。蛋白质芯片特点：①快速、简便、易行高通量平行分析，一次完成上万种蛋白质样品分析；②较高的信噪比；③所需样品量极少，25～50个细胞所提取的蛋白质即可进行分析；④易于与基因芯片结果比较分析，在基因组和蛋白质组间建立联系；⑤对小分子量的蛋白质鉴定有效（＜20 000），不能完全取代双相电泳-质谱技术。

3.蛋白质芯片技术的发展现状　目前的主流技术是蛋白质芯片与质谱技术结合产生的表面增强激光解析离子化-飞行时间-质谱技术（SELDITOF-MS），该技术专利主要由美国Ciphergen应用生物系统公司拥有。无需复杂的样品制备该技术即可直接分析患者的血液、尿液、脑脊液等样品，操作简单、高效、快速、准确，该技术可应用于临床的蛋白质组检测技术。芯片宽10mm、长80mm，细胞、体液中提取的蛋白质混合物与芯片孵育，洗去不与芯片结合的蛋白质及杂质分子后滴加能量吸收分子，自然风干后将芯片放入SELD I-TOF-MS仪器，激光激发下芯片上的待检蛋白质解离后在电场作用下到达检测器，飞行到达检测器的时间取决于离子不同的质荷比，通过质谱图上的谱峰不同鉴定蛋白质。QIAGEN公司的液相蛋白质芯片系统以xMAP（flexible multi-analyte profiling）技术为基础，样品待测物与固定在球形反应基质上的探针分子结合反应，用特异绿色荧光标记分子来标记检测，该平台可在一次样品检测中同时进行100多种不同的分析，该系统可对微量级的样品同时进行多种检测、操作简便、耗时短、通量大、蛋白质纯化分析一次完成。Biacore公司开发的Sensorchip系统主要用于研究蛋白质的相互作用；原理是利用蛋白质分子不同部位的基因突变，构建不同的蛋白质分子制成蛋白质芯片，然后与靶分子反应；体外研究蛋白质翻译过程中催化因子的组装机制、酶复合体的组装机制和顺序、鉴定蛋白质分子不同部位的活性和功能。我国研究了一种光学蛋白质芯片技术平台，通过芯片载体表面格式化、表面改性和配基固定形成多元生物活性感应表面，借助蛋白质的特异结合和高分辨率的生物光学显微成像技术达到识别和检测的目的，无需样品分离、纯化和标记，不影响样品蛋白质的生物结构和活性。

4.SELD I-TOF-MS技术在妇科肿瘤早期诊断中的应用　表面增强激光解吸离子化飞行时间 质 谱（surface enhanced laser desorption/ ionization-time of flight mass spzectrometry，SELD I-TOF-MS）利用系列设计的具有不同表面修饰的芯片，使其能够选择性地结合被检标本中的蛋白质，被结合的蛋白质在添加能量吸收分子后在特异激光作用下解离，解离成正电离子通过电场，检测其在电场中的飞行时间，检测到的信号由高速模拟数字转换器转换并记录，最后被检测蛋白质以一系列峰值的形式呈现，这些特异性波峰构成了该疾病特有的指纹图谱。指纹图谱的横坐标代表蛋白质类型，纵坐标代表蛋白质的丰度，单个蛋白质分子的位置取决于其飞行时间。SELD I芯片，按检测目的将表面修饰为化学和生物两种类型，化学芯片包括：疏水表面、亲水表面、阳离子表面、阴离子表面、金属离子螯合表面、混合芯片6种；生物芯片分为抗体-抗原表面、受体-配体表面、酶-底物表面、DNA-蛋白质表面芯片等。

SELD I芯片的特点：①测定样品范围广，如：血清、尿液、体液、细胞培养液等，可以直接点样进行检测分析；②分析样品用量只需要0.5～5 μl或2 000个细胞；③适合分析分子量20 kDa以下的蛋白质；④检测速度快。2002年SELD I技术发明以来发展十分迅速，其综合了芯片微阵列和质谱技术的优点，增加了特异性阅读系统和分析软件，能够快速进行蛋白质的分析鉴定，在肿瘤标记物分析越来越深入，已经作为癌症的特征蛋白质表达图谱研究与诊断工具，SELD I蛋白质芯片技术对结直肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、宫颈癌等临床诊断研究取得了可喜的成绩。

CA125是卵巢癌血清学诊断最常用的肿瘤标记物，但该抗原Ⅰ期患者阳性率仅为50%左右。美国癌症研究所等单位应用SELD I技术对50例卵巢癌、66例非恶性卵巢肿瘤、63例正常人血清进行分析，结果该技术对卵巢癌诊断的敏感性100%、特异性95%、阳性预测值94%。Petricoin等运用SELD I疏水性蛋白芯片技术对50例卵巢癌及50例非卵巢癌患者血清进行分析，结果有五个蛋白峰发生变化，其中四个蛋白峰中卵巢癌患者的表达高于非卵巢癌患者，应用该蛋白质组模型分析116例进行盲筛，结果该方法对卵巢癌患者的敏感性100%、特异性95%、阳性预测值94%。Zhang 等对503份血清样本进行盲筛和交叉验证，发现3 种对早期卵巢癌有意义的生物标记物并进行了纯化鉴定，分别为载脂蛋白A、剪切型甲状腺素转运蛋白、α-胰蛋白酶间抑制物重链H4的一个剪切片段，3种标记物与CA125联合检测敏感性95%，特异性97%。大量实验数据提示SELD I技术可用于卵巢癌的早期诊断，进而大大改善了患者5年存活率。

宫颈癌的筛查主要依靠阴道镜宫颈细胞学检查和人乳头瘤病毒的分型检测，细胞学诊断受诊断者技能和经验的影响，假阴性诊断约13%～45%。大量研究证实，持续高危型HPV感染是导致宫颈高度病变进而发展为宫颈癌的主要原因，对HPV进行检测及分型是一种有效的、可靠的宫颈癌筛查手段，HPV分型检测有赖于分子生物学技术水平的提高，寻找早期辅助诊断宫颈癌实验室诊断方法，以提高宫颈癌诊断的敏感性和特异性是非常必要的。YW LIN等应用SELD I芯片技术对宫颈鳞癌、宫颈原位癌、正常对照组血清进行研究，建立的分类模型对宫颈癌诊断的灵敏度为91.00%、特异性为97.00%，鉴别宫颈鳞癌与宫颈原位癌的灵敏度为92.00%，特异性为97.00%。Wong等宫颈浸润性鳞癌与正常宫颈组织进行分析，筛选7种差异表达的蛋白质，应用该分类记分系统对宫颈癌的早期诊断特异性为100%、敏感性89%、阳性预测值100%、阴性预测值86%。

子宫内膜癌尚无血清学指标，子宫内膜癌的早期筛查也缺乏有效手段。Yang等用SELD I芯片技术在子宫内膜癌患者血清中筛查到多种肿瘤标记物，较为特异的是chaperonin 10，该蛋白是经弱阳离子交换层析技术鉴定的，并得到Western blot和免疫组化染色证实，研究表明chaperonin 10的过表达对于子宫内膜癌的早期诊断具有重要意义。

肿瘤是全身性的复杂疾病，肿瘤的发生涉及到多个通路和多个基因的参与，是多阶段逐步演变的过程，如能在肿瘤的早期阶段进行诊断，通过手术、放疗、化疗等手段进行规范治疗，肿瘤患者可以治愈，因此随着医学的不断进步，影像、介入技术、测定肿瘤标记物等技术的不断发展，最终对肿瘤早诊断、早治疗，到达完全治愈。

（郑建华　孙宇辉）