肿瘤分子诊断技术和途径

（一）临床常用的分子检测技术及特点

1.聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）　是选择性体外扩增DNA或RNA的方法，包括变性（Denature）、退火（Anneal）和延伸（Extension）三个基本步骤，经25～35轮循环可使DNA扩增达106倍，因此仅需要很少的组织样品，就可作为核酸分析。PCR技术具有高度的灵敏度，但同时高度的敏感性也是PCR技术的缺点，容易由于外源性污染出现假阳性结果。

2.反转录PCR（reverse transcriptase-PCR，RT-PCR）　首先以目的mRNA为模板反转录合成cDNA，再进行PCR扩增。这项技术能够从混合了大量高丰度mRNA的样品中检测到少量低丰度mRNA的表达情况。

3.Southern印迹杂交　是最先被用于诊断检测的分子技术之一，通过标记过的互补DNA探针与经限制性内切核酸酶消化、凝胶电泳分离和转膜的DNA片段杂交，确认特定的DNA序列变化。该技术的局限性是灵敏度比较低，对样品DNA的质和量要求较高。

4.Northern印迹杂交　通过标记过的互补序列cDNA或RNA探针与琼脂糖凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜的待测样品RNA杂交，分析RNA改变。该分析的特点能够提供更精确的RNA定量信息，但是它对于样品RNA的质和量的要求很高。

5.突变检测技术　PCR扩增后的待测样品DNA用特定限制性内切核酸酶处理，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物，根据片段长度的变化来检测突变，称为扩增的限制性片段长度多态技术，该技术利用了限制性内切核酸酶的DNA识别序列来检测已知点突变、微小的缺失。单链构象多态性和变性梯度凝胶电泳分别以单链DNA和双链DNA为对象进行突变检测。

6.荧 光 原位 杂 交（fluorescence in situ hybridization，FISH）　用荧光标记的DNA探针直接在细胞的分裂象染色体和间期细胞核以及组织切片上进行杂交，能对任何给定的基因组区域进行特异性杂交，相对于PCR技术FISH可以将DNA异常原位显示和定量分析，随着共聚焦显微镜和图像分析程序的发展，对石蜡包埋的组织样品增加了该技术在基因诊断中的应用价值。

7.免疫印迹分析　从细胞或组织样品中提取的蛋白质以聚丙烯酞胺凝胶电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性抗体作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术可检测到低至5 ng中等大小的靶蛋白。这项技术结合了凝胶电泳较高的分辨率和免疫化学检测的特异性。这种方法的主要缺点在于需要大量的组织样品以提取足量、优质的蛋白质。

8.基因芯片技术　通常指DNA芯片，将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片技术关键就是基因芯片具有微型化、集约化和标准化的特点，基因芯片的种类有光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列、微电子芯片、微量点样技术、毛细管微流泵芯片等。利用基因芯片系统可以进行已知基因的测序或突变分析、基因型鉴定、基因多态性分析、基组内的区域扩增或缺失分析，能够更全面、更真实地反映了生理或病理功能状态下基因之间相互作用的情况。基因芯片技术主要应用在于肿瘤、感染性疾病的分子诊断方面，用于研究遗传性突变、肿瘤组织、炎性器官以及病原体的特异性分子结构和表达谱。在临床应用方面，Affymetrix公司开发出p53基因芯片，将已知p53基因全长序列和已知突变的探针固定在芯片上，用于恶性肿瘤的早期诊断；华盛顿大学研究了卵巢癌中基因表达谱的变化，芯片上5 376个基因探针选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞及正常卵巢的cDNA文库，342个来自EST克隆，包括已知确定的管家基因、细胞因子及因子受体基因、生长因子及受体基因、细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿瘤相关基因，证实了基因芯片分析生物体系中分子变化的可行性。

9.组织芯片（tissue microarray，TMA）同一时间分析大批量组织样品中某一蛋白质的表达，还可以对DNA和RNA进行原位检测。能够同时提供大量的分析信息，消除不同批次检测试验之间的系统误差。

10.蛋白质芯片（protein array）　是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种方法，类似于基因芯片技术，是将蛋白质点到固相物质上，与要检测的组织或细胞等进行抗体与抗原在空间构象上相互识别，再通过自动化仪器分析得出结果。其优点：①蛋白质芯片是一种“高通量”的研究方法，能够全面、准确的研究蛋白表达谱。②蛋白质芯片的灵敏度高，检测蛋白样品中ng级微量蛋白。③蛋白质芯片具有高度的准确性。蛋白质芯片制作费时，费力，且成本较高。

（二）肿瘤分子诊断途径

1.肿瘤相关基因蛋白的测定　随着分子生物学技术的发展，在分子水平上发现基因结构、功能的改变、基因产物的非正常表达均与肿瘤的发生密切相关。癌细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，或是宿主对体内新生物反应而产生并进入体液或组织中的物质称为肿瘤标志物，如：甲胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白抗原CA125等，测定血清中肿瘤标记物的含量可以协助恶性肿瘤的早期诊断。检测肿瘤标记物方法包括：蛋白质印迹法、免疫组织化学技术、酶联免疫吸附测定、放射免疫电泳、流式细胞仪测试法等。

2.肿瘤易感基因的测定　研究发现有些肿瘤的发生与患者携带的肿瘤易感基因有关，如：视网膜母细胞瘤的Rbl基因、Li-Fraumeni综合征的p53基因、遗传性非息肉性结直肠癌的HNPCC基因、乳腺癌的BRCA1基因等。对于易感基因的检测对于高危人群的疾病筛查具有重要的临床意义。

3.DNA甲基化的测定　DNA甲基化是DNA的修饰方式之一，是基因表达重要调控方式，通过对基因的DNA甲基化修饰起到以下作用：①直接干扰特异转录子与它识别的部位结合，甲基化结合蛋白质优先结合甲基化的启动子，防止转录子与特定序列结合，DNA甲基化与染色体结构的关系，与转录抑制因子结合引起基因沉默。②参与胚胎发育的调节，保证胚胎进入正常发育阶段，并调控不同发育阶段的相关基因表达。③X染色体特定基因失活。④病毒DNA、不利的重复序列、寄生序列的失活。⑤细胞的分化和增殖、衰老调控。⑥肿瘤细胞甲基化类型频繁变化，总DNA的低甲基化、区域DNA的高甲基化、癌基因的低甲基化表达、抑癌基因高甲基化失活，使肿瘤细胞增殖、浸润。

研究认为甲基化与肿瘤的发生相关，其机制包括：①抑癌基因的一个拷贝的突变和缺失，另一拷贝的甲基化失活，是抑癌基因的失活机制。②肿瘤细胞中5-甲基胞嘧啶突变。③肿瘤细胞甲基化水平下降，癌基因去甲基化表达活跃，引起细胞异常分化、增殖、癌变。常用的DNA甲基化的研究方法包括：限制性内切酶及PCR法、硫酸盐测序法、变性高效液相色谱、结合亚硫酸氢盐处理和酶解分析、甲基化的荧光检测、甲基化敏感内切酶法、酶区域性甲基化分析等。

4.端粒酶及其活性测定　细胞分裂过程中丢失少量端粒DNA，体细胞端粒长度缩短到一定程度即进入衰老，如果细胞失去这种调控机制无限增殖即有可能发生癌变。研究发现大多数人成体细胞中缺乏端粒酶，良性疾病以及癌前病变中一般也缺乏端粒酶，恶性肿瘤周围的组织内也无明显端粒酶活性的表达，85%的恶性肿瘤组织中可测到端粒酶，端粒的长度与疾病的严重程度呈负相关，且端粒酶活性的高低同患者的预后直接相关。端粒酶活性的检测方法是端粒重复扩增方案（telomere repeat amplification protocol，TRAP），测定标本中端粒酶活性具有高度敏感和特异性，局限性在于端粒酶中含有RNA成分.其活性不稳定易被降解，同时用时较长；原位TRAP检测显示细胞核内端粒酶活性，避免了TRAP方案不能了解端粒酶活性是来自肿瘤细胞、还是肿瘤标本中其他细胞。测定腹水、胸腔积液、血浆等体液中端粒酶活性，研究与肿瘤分期的关系取得了一定的进展，卵巢癌患者腹水中，端粒酶活性阳性率为88%，高于细胞学测定结果，且假阳性率低。

5.肿瘤基因表达绘图　肿瘤细胞的增殖和分化受基因调控，将基因表达绘图技术应用于肿瘤研究中，有助于揭示肿瘤发生、侵袭、转移的机制，为肿瘤的分类、分期及预后提供基因水平的依据，为肿瘤的治疗寻找新的靶点。如研究发现子宫内膜癌与微卫星的不稳定、PTEN基因功能的丧失有关，PTEN是肿瘤抑制基因，子宫内膜的癌前期PTEN丢失更为常见，提示PTEN的丢失可能是子宫内膜癌发生的早期标志；基因表达图谱通过对子宫内膜癌组织的基因检测，得到了子宫内膜癌发生、发展是多个基因的共同作用的结果，提示对于子宫内膜癌应以基因的改变作为治疗靶点。