荧光原位杂交技术的基本原理是使用核酸探针（DNA或RNA）与染色体或靶DNA进行杂交，然后用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或靶DNA的定性、定位、甚至相对定量地分析，迅速获得结果，具有经济、安全、特异性好、灵敏度高等优点。随着荧光原位杂交的发展，还出现了多彩色荧光和染色质纤维荧光等原位杂交新技术。FISH技术已在国外广泛开展用于液基细胞学的各种标本。
表皮生长因子受体（EGFR）基因是一种有酪氨酸活性的糖蛋白，由于非小细胞癌存在EGFR基因的扩增突变以及过度表达，许多抗肿瘤靶向药物有助于这种患者的治疗，如表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制药（EGFR-TKI），包括吉非替尼（易瑞莎），其可以竞争性结合于细胞表面的EGFR-TK催化域Mg-ATP结合位点上，阻断EGFR生成信号向细胞内传递，使细胞周期停止在G0/G1交界期；厄洛替尼（特罗凯），可以选择性抑制EGFR相关的TK活性以及细胞内磷酸化过程，从而抑制下游信号通路，拮抗血管生成、细胞扩散及增殖作用，阻断肿瘤细胞生长。因此，EGFR的表达与否有助于非小细胞癌患者的治疗。
事实上，EGFR可以通过酶联免疫、免疫组织化学、Western blot、Northern blot、RTPCR等多种方法来检测，而在细胞学上，荧光原位杂交技术尤为适用。
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行变性—退火—复性一系列程序，即可形成可被检测的靶DNA与核酸探针杂交体。运用这种方法可以发现多倍体细胞，并准确检测EGFR基因的表达情况，它的结果客观，以雅培（Abbott Molecular）公司的LAVysion多色荧光探针试剂盒（Multicolor Probe，20Assays，LS32-131095）为例，现将多位点FISH标本的制备步骤介绍如下。
LAVysion的多色荧光探针试剂盒包括这样一些多位点的特异性探针，即5p15、7p12（表皮生长因子受体，EGFR）、8q24（cmyc基因）以及6号染色体的着丝点探针。
将收到的支气管刷检细胞学标本用乙醇喷雾固定。之前不需要对载玻片进行任何处理。灌洗液标本用50ml离心管收集，常含有血液。50ml离心管用400g离心10min，将沉淀的细胞转移到15ml的离心管做进一步处理。为了溶解红细胞，将氯化铵（ACK）裂解液［150mmol/L的NH4Cl，1mmol/L的KHCO3，0．1mmol/L的EDTA Na2（pH 7．3）］添加到管中（标本和ACK裂解液共添加至13ml），并在室温下放置10min。随后，将成分为3∶1的甲醇：冰醋酸固定剂1ml添加到标本和裂解液混合液的离心管中，涡流混匀，并在400g下离心8min。弃去上清液后，再加入大约10ml的成分为3∶1的甲醇：冰醋酸固定剂，将这些沉淀的细胞重复洗涤3次，之后再离心，弃去上清液，留下1．5～2．0ml的3∶1固定剂在离心管中。将这些沉淀的细胞转移到1．8ml的微量离心管，从中吸取10μl的细胞悬液，然后放置在一个刻有直径1cm圆环的载玻片上并待干。随后用相差显微镜评价载玻片上的细胞密度（即细胞数量）。如果细胞数量较少，就再滴加细胞悬液。理想的细胞数量被认为是细胞量达到最大，以载玻片上的细胞无明显重叠为宜。
FISH预杂交和杂交。将刷检涂片浸泡在新鲜配置成分为3∶1的甲醇：冰醋酸固定液中10min。这将有助于去除多余的碎片并做好标本杂交前准备。灌洗液标本则不需要这一步骤。除此之外，这两种标本的预处理和杂交程序相同。10μl的探针适用于22mm×22mm范围的刷检标本涂片，3μl的探针适用于灌洗液标本涂片。利用原位荧光杂交仪进行标本的DNA和探针的DNA联合变性并杂交。变性温度定在73℃，3min；而杂交温度定在37℃，10～16h，杂交完毕后，将涂片用2×SSC/0．1%NP-40在76℃下洗涤1min。随后用DAPI（4’，6二脒基-2-苯吲哚盐酸）进行复染，最后放置盖玻片在荧光显微镜下进行分析。
FISH异常的标准：扩增（Gain）的定义是使用某一给定的探针时出现了3个或更多的信号。而多倍体细胞被定义为使用这4种探针时，有2种或多种探针显示一个细胞内出现了扩增的情况。四倍体细胞则显示这4种探针中的每一种都有4个拷贝。根据以往的数据，判断一个病例是恶性的阳性结果，只要出现5个或更多的多倍体细胞即可，此时可无视涂片中的细胞总数。而对于四倍体来说，需要≥10个四倍体细胞才可被认为结果是阳性（图7-7）。
图7-7 三色探针检测宫颈非典型增生细胞中3q扩增
四倍体细胞数和hTERC表达水平随病变严重程度增加
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