干细胞移植治疗早期股骨头缺血性坏死

1．原理　ANFH的自然转归往往是骨塌陷，伴有疼痛、跛行等严重功能障碍。早期预防塌陷，促进骨再生是治疗的关键。缺血坏死发生后导致成骨、成血管能力不足，微循环障碍影响坏死区的修复。近年来在细胞水平观察发现坏死区及周边干细胞活性下降，数量明显少于正常部位，导致修复障碍。

骨髓干细胞（BMSCs）具备两个重要特征：强的自我增殖能力和多分化潜能。在不同条件影响下具有向骨、软骨、脂肪、肌肉（心肌）及神经细胞等组织分化的潜能。利用干细胞的特点结合骨坏死后的细胞病理变化，采用自体髂骨干细胞移植是具有针对性的手段。我们采用COBE血细胞分离机（图3-2-8）分离骨髓血干细胞，经过流式细胞仪分析，逐步摸索出适宜的参数。选择有利于收集更多的含有具有间充质干细胞特点的细胞。进行了骨髓间充质干细胞分离的相关因素分析，为标准化应用提供了有效保障。利用流式细胞技术联合检测多株骨髓细胞的表达并进行了相关分析，确认了CD271阳性表达细胞株能够作为间充质干细胞的标记物，使干细胞技术的临床应用的可行性、有效性有了充分的证据，也为进一步开展干细胞研究在细胞标记物的选择方面奠定了基础。

图3-2-8　血细胞分离机COBE Spectra 6．1

由于干细胞数量的减少是导致骨修复能力下降的重要原因之一，有效补充干细胞数量是促进修复的基础。因此，在确定干细胞移植采集骨髓血量方面，考虑到细胞分离机转机的要求及修复需要的干细胞数量等因素，确定采集骨髓血量为400ml，其中含有肝素抗凝血剂盐水80ml。分离后细胞悬液细胞计数平均为50×109/L，以每髋注射30ml为标准，根据流式细胞仪测定结果，CD271＋细胞株含量可以达到有核细胞数的0．5%左右，绝对数可以达到1×105个/ml以上，30ml细胞悬液含有的间充质干细胞细胞总数达30万以上。可以为骨再生提供充足的细胞成分。

2．方法　手术在连续硬膜外麻醉下进行。

（1）骨髓采集方法：用Gallini骨髓采集针自双侧髂嵴粗隆处连续向不同方向、不同深度、不同部位多点抽取，使用10ml注射器，含有2ml肝素盐水，每次抽到10ml，共采集骨髓血400ml，注入400ml含枸橼酸溶液（ACD）的标准血液采集袋内。

（2）骨髓血分离与采集：滤过骨髓血后用COBE Spectra6．1细胞分离机骨髓处理程序进行间充质干细胞分离，分离前后分别做有核细胞悬液的总数、分类及流式细胞分析。单侧骨坏死收集30ml；双侧收集60ml。每髋注入30ml。注入时观察细胞悬液在股骨头内的分布情况，见图3-2-9。

图3-2-9　观察骨髓干细胞悬液的分布情况

穿刺后注入造影剂，显示细胞悬液从中央至软骨下，然后沿股骨头周围返回近端头颈区

（3）细胞悬液的回注与髓芯减压：在C形臂X线透视机引导下用3mm空心钻自大粗隆顶点远端5cm外侧皮质钻入，达到股骨头软骨下骨2cm处，注意切勿穿入关节腔，防止注入细胞悬液渗漏进入关节。取出空心钻，保留导针，改用3．5mm直径的Gallini骨穿刺活检针沿导针穿入，达到股骨头软骨下骨1cm处。用10ml注射器经穿刺针将浓缩的细胞悬液分次缓慢注入股骨头内。穿刺和注入过程均在X线监视下进行，以免穿刺针穿出股骨头。

（4）髓芯减压术：对其中56髋ARCO为Ⅱb至Ⅱc期患者在行细胞移植后行3mm斯氏针多方向钻孔髓芯减压，以降低骨内压力并利于改善骨髓内的血液循环。穿刺方向为前内上、前外上、后内上、后外上下、中央及内侧多方向，进针点根据需要可更换。

（5）骨髓血回输：细胞悬液提取后，将剩余骨髓血用盐水洗涤为悬浮红细胞后回输给患者。

（6）术后处理：手术后患者卧床休息1～2d，然后可下床活动，限制负重不超过30kg，对于无症状的Ⅰ期患者术后1～2d可在保护下下床负重活动。