肺部肿瘤的分子生物学诊断

时间：2022-03-16 理论教育版权反馈

【摘要】：随着肿瘤发生的分子事件逐步被揭示，如何利用分子生物学方法通过痰标本进行肺癌癌前病变和早期肺癌的检测，一直是国内外研究的热点。目前所应用的检测肺癌患者体内各种异常分子的分子生物学方法主要包括以DNA、RNA及蛋白质为基础的3种检测方法。在临床实践中，采用由肿瘤组织、支气管灌洗液及痰液中提纯的DNA来评价肺癌组织的分子生物学改变。肿瘤细胞的免疫细胞化学检测可以更准确地确定肺癌的分期，这种分期与患者预后关系密切。

我国肺癌发病率和病死率近年来一直呈现上升趋势，且在所有癌症中上升幅度最大。在我国北京、上海、重庆、河南、天津、延边、云南等省市，肺癌也已经成为恶性肿瘤中的重要杀手。

临床上确诊的肺癌患者绝大多数处于中、晚期，治疗效果不佳、预后不良。当肺癌处于鳞状化生、不典型增生、原位癌、甚至微小浸润癌阶段时，有多种有效的治疗手段，90%的病人可以彻底治愈。因此提高肺癌治疗效果的关键是如何对肺癌高危人群进行有效的筛查和对肺癌的前期病变进行准确诊断。随着肿瘤发生的分子事件逐步被揭示，如何利用分子生物学方法通过痰标本进行肺癌癌前病变和早期肺癌的检测，一直是国内外研究的热点。目前所应用的检测肺癌患者体内各种异常分子的分子生物学方法主要包括以DNA、RNA及蛋白质为基础的3种检测方法。

一、DNA水平检测方法

DNA是一个极好的分子分析材料，十分稳定并可通过PCR方法迅速扩增，扩增后的DNA可用于进行各种分析检测，例如基因突变检测、杂合性缺失检测及微卫星分析等。在临床实践中，采用由肿瘤组织、支气管灌洗液及痰液中提纯的DNA来评价肺癌组织的分子生物学改变。近年来，全血和血清已成为新的提取底物，用以分离和鉴定血清中游离DNA分子的改变。检测存在于循环中的DNA可以用作替代原料，来检测发生在原发肿瘤中的分子改变，已有报道描述许多方法在临床上用于血样中点突变检测。

1．p53基因突变　p53基因是重要的肿瘤抑制基因，同时肺癌中p53基因突变率较高。其位于17号染色体短臂的1区3带，是一个关键且有效的调节子，可调节细胞对具有遗传毒性的损伤做出反应。p53基因在肺癌中有很高的突变率，非小细胞肺癌（NSCLC）为50%～60%，小细胞肺癌（SCLC）超过80%。因此研究肺癌中p53基因突变对于明确其在肺癌发生中的作用及其所处的阶段具有重要的意义。通常利用DNA直接测序的方法来检测p53的突变，可提供更多的参考信息，包括突变位点及突变类型等。

2．基因超甲基化　人们认为超甲基化导致了mRNA不表达，这种后天形成的变化被认为是肿瘤抑制基因失活的一个重要机制。有研究表明，甲基化的结构控制着两个主要的引起肿瘤发生的机制。近年来一种新的评价p16甲基化的方法，称为甲基化特异性PCR（MSP）。在这种方法的实验中，纯化的癌细胞DNA被亚硫酸钠化学性修饰，在PCR进行前，修饰的DNA被纯化、脱硫及沉淀，两套引物被用作PCR扩增。其中的一对引物识别某一种序列，该序列在CpG位点未被甲基化（被重硫酸盐修饰为UpG），而另一对引物识别另一种序列，此序列在CpG位点被甲基化（未被重硫酸盐修饰）。这一实验只需使用少量的DNA模板（小于200ng）即可完成，而从非甲基化背景中检测甲基化等位基因的敏感性却可大于104。检测血清中DNA的MGMT异常甲基化是一个非常有前途的临床研究方法，通过分析在支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）液中的DNA甲基化状况，可提供一个新的用以评价肺癌患者的生物学手段。

二、RNA水平检测方法

发生在原癌基因与肿瘤抑制基因中的遗传变化不仅能在DNA水平得到评价，同样也可在RNA水平得到评价。尽管已知在RNA水平可进行各种分子生物学评价，但其中有许多方法对于小样本临床标本的研究并没有足够的敏感性，例如Northern印迹和核糖核酸酶保护试验等。另一方面，由于RNA十分容易降解，因而它作为临床研究的底物来说不如DNA。而RT－PCR则提供了一个十分敏感的方法，能够对mRNA水平进行准确测量，甚至可以从100万细胞中测量某个单一细胞的异常。RT－PCR试验的方法主要是检测靶组织中的表达缺失，这些靶组织包括淋巴结、骨髓和血液。人们认为这些表达缺失与靶组织中出现肿瘤细胞有关，因为具有这些缺失的肿瘤细胞可在血液中得到修复。许多近期报道的研究结果显示了RT－PCR检测肺癌微转移的潜力，细胞角质素和癌胚抗原（carcino－embryonic antigen，CEA）的信使RNA已经被作为检测肺癌患者循环中肿瘤细胞的标记物。

三、蛋白质水平检测方法

已知p53基因突变可导致p53蛋白稳态水平的提高。在正常条件下p53蛋白半衰期短，在细胞中积累蛋白量不能被免疫组化方法检测到。相比之下，具有突变的分子则有一个长的半衰期，并可在细胞中积累到一个可被免疫组化方法检测到的水平。但此种方法会得到大量假阴性和假阳性结果。由于p53蛋白可以被其他细胞蛋白加以稳定或阻止密码子突变，因而通常会导致失效的p53蛋白产物的出现。近来一个由美国食品和药品管理局（food and drug administration，FDA）批准的通过免疫组化方法检测HER2过度表达的试剂盒已被引入临床，用以优化乳腺癌的治疗策略，同样的研究重点也被应用到了肺癌方面的研究上。科罗拉多州癌症中心的研究发现，大约有25%的非小细胞肺癌出现HER2／Neu过度表达。肿瘤细胞的免疫细胞化学检测可以更准确地确定肺癌的分期，这种分期与患者预后关系密切。在过去的几年中，人们提出了许多肿瘤相关单克隆抗体作为检测早期肺癌的工具。一项通过对高危人群痰液中剥落的支气管上皮细胞做免疫细胞化学试验的研究，准确性达到90%。

痰标本作为直接来源于肺的检测样本对于肺癌的早期筛查、早期干预而言有着重要的地位和独特的优势。基因的点突变在肿瘤的发生、发展过程中可能扮演着极其重要的角色，各种致癌因素和抑癌因素极有可能是通过诱发和（或）抑制点突变来发挥作用的。

近年来从基因探针技术发展而来的生物芯片将更加准确地对基因进行空间定位。人们可以利用DNA芯片来分析特异的基因顺序，同时对不同的mRNA表达水平进行检测。除此之外，一种以cDNA微排列技术为基础的新方法正在发展阶段，结合了荧光原位杂交的技术，可以对发生在不同种类恶性疾病中的分子改变进行快速筛选，这项技术已经用于肺癌的预后判定。随着人类基因组计划的完成，国内外对疾病的研究从基因水平深入到了单个核苷酸，即通过单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNP）来对疾病进行评价。SNP是继限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP）和微卫星多态性（microsatellitepolymorphisms）之后出现的第3代遗传标记，其在染色体中的分布密度远高于RFLP和微卫星标记，显示出广泛的应用前景，同时还具有遗传稳定性好、代表性强等特性，因而是一种较理想的研究途径。从SNP得到重视以来，人们对SNP的研究方法进行了许多探索和改进。传统的方法有单链构象多态性分析（SSCP）、等位特异的寡核苷酸杂交、寡核苷酸连接分析以及引物延伸分析等。新方法包括焦磷酸测序、芯片技术阵列分析、变性高效液相色谱、能量转移标记的等位特异PCR、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱等。以SNP为基础的关联分析及连锁不平衡分析已广泛应用于心血管系统、神经系统及癌症等系统的研究中。现阶段，研究者们拟采用SNP的分析方法来分析人体p53抑癌基因中某些SNP位点与肺癌的易感性及放疗敏感性的关系，希望能找到一个与肺癌易感性密切相关的SNP位点，提高对肺癌的早期诊断及综合治疗的水平。

（刘　杰　王北宁）

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