既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但标准的PCR不能对目的片段进行组织学定位。原位PCR（in situ PCR，IS－PCR）技术是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合，在不破坏细胞形态和结构的前提下，利用原位完整的细胞作为1个微反应体系来扩增细胞内的靶序列，是在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培养细胞玻片上来检测和定位核酸的技术。目前已有专用的原位PCR仪用于检测，IS－PCR成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。该法可用于检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排，以及分析细胞内RNA表达产物等，在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。
（一）组织或细胞的固定
细胞或组织的固定是IS－PCR成功与否的关键。合适的固定，既要保证细胞形态学上的完整，又要使细胞保持一定的通透性，使PCR反应混合物得以渗入细胞内，同时又能阻止扩增产物扩散到细胞外，使扩增产物在细胞内更好地定位。
目前使用的固定液主要有甲醛、丙酮、乙醇、水银等。固定时间：甲醛为5min，丙酮和95%乙醇为15h；若温度为室温或37℃，则固定24～48h可获得最强信号。随着固定时间的延长，可能减少细胞的通透性，从而减少PCR产物的扩散，但却不利于PCR反应混合液进入固定的细胞内。这时可利用胃蛋白酶、蛋白激酶K等消化固定的细胞或组织，以增加细胞的通透性，从而有利于PCR反应的进行。譬如利用甲醛固定15h后，再用2mg／ml胃蛋白酶消化12min，则细胞阳性检出率可高达100%。
据标本种类不同，其处理的方法各异。细胞涂片或培养细胞玻片的固定多用甲醇∶醋酸3∶1或4%多聚甲醛，固定后的样本置于－20℃冰箱储存；对悬浮细胞，也多用4%多聚甲醛固定，并需在25倍体积的70%的乙醇中－20℃储存；新鲜组织块则多在10%中性缓冲甲醛中隔夜固定后使用；石蜡包埋组织切片经常规脱蜡、梯度乙醇水化等过程后可直接使用。
（二）预处理
预处理的目的在于适当增加细胞膜的通透性和消化与靶DNA或RNA结合的蛋白质，如组蛋白等。对于不同的材料，预处理的方法各异。一般而言，细胞材料不需预处理或者仅用去垢剂（Triton、NP－40和Tween－2等）处理后即可用于原位PCR。组织切片固定后均需用蛋白酶或去垢剂预处理，且预处理的程度把握很重要。若处理不足，会影响试剂的掺入和靶序列的暴露；若处理过度则会导致样本形态破坏和PCR产物扩散，甚至脱片。此外消化的强度还与组织固定的时间有关。固定时间越长，消化强度应相应增加。常选用的酶有胰蛋白酶或胃蛋白酶，蛋白酶K的选用在酶浓度和消化时间上应特别注意，否则会导致扩增产物扩散，信号减弱或消失以及定位困难等。蛋白酶消化不充分是原位PCR失败最常见的原因。蛋白酶消化后，要通过加热或洗涤等方法将剩余的酶除去。因为即使少量酶残留，也可能破坏随后的PCR反应体系中的DNA聚合酶，从而影响PCR的扩增。
（三）热启动（heat start）
在PCR扩增前，预先把组织切片与部分PCR反应混合液预热到一定温度，一般在55℃以上，然后再加入引物及Taq DNA聚合酶，可大大增强IS－PCR的成功率，明显减少非特异性扩增产物。原因可能是热启动降低了引物与细胞内DNA的结合，从而减少错配率。
单链DNA结合蛋白（SSB）具有类似热启动的作用。在不使用热启动的情况下，SSB可增加IS－PCR的特异性及敏感性。SSB与引物的最适比例为1∶12。过高或过低时，负反应会高于特异性反应，从而导致IS－PCR的失败。
（四）细胞内目的片段的扩增
热启动处理后的切片，加入引物及Taq DNA聚合酶后即可放入原位PCR仪进行扩增反应。保温时间及循环周期与液相PCR相比，原位PCR每1个步骤的保温时间都应相对地延长，Haase等报道在进行细胞悬液标本间接法原位PCR时，其变性、退火、延伸的保温时间分别是2min、2min和90s。另外原位PCR循环次数的控制也很重要，为获得足够的产物用于检测，一般需要20～40次循环。
（五）扩增后的处理
原位扩增结束后，标本要充分洗涤，以除去弥散到细胞外的扩增产物，否则会增加信号检测时背景的非特异性着色。在原位扩增后用4%多聚甲醛或2%戊二醛进行后固定可减少扩增产物的弥散。
（六）PCR产物的检测
IS－PCR产物的鉴定有直接法及间接法2种。直接法是把标记好的dNTP或生物素、荧光素等直接加到PCR反应体系中，这样所扩增的片段就带有标记，可直接检测。间接法则是先行PCR后，再加入标记好的探针与扩增产物杂交。两种方法各有利弊，前者较方便，但假阳性率较高，后者正好相反。直接法假阳性率高的原因可能是在原位杂交时地高辛等标记物与DNA聚合酶等非特异性结合，并与循环次数有关，但与引物无关。
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