免疫荧光技术是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。其基本原理是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，用这种标记抗体或抗原作为探针与组织内的相应抗原或抗体结合，所形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。常用的荧光素有：①异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），分子量为389．4，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。性质稳定，低温避光可长期保存。②四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC）是罗丹明（rhodamine）的衍生物。最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。
免疫荧光法可分为以下三种。
（一）直接法
【基本原理】 是用已知的抗体（或抗原）标记上荧光素后成为特异性荧光抗体（或抗原），直接检查出组织或细胞中的抗原（或抗体），这是最简便快速的方法。
【主要特点】 本法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检IgA、IgM、IgG、C3c、C4c、C1q的检测和病原体的检测。其缺点是一种荧光抗体只能检测相应的一种抗原，敏感性较差，效果有时不理想。
【染色步骤】
（1）冷冻切片、细胞涂片以冷丙酮固定。
（2）滴加经稀释至染色效价比的荧光抗体，37℃，30～60min或4℃过夜，置湿盒内。
（3）PBS洗2次，每次5min，蒸馏水洗1次，1min。
（4）50%甘油缓冲液封片。
（5）荧光显微镜下观察。
（6）对照染色。
（二）间接法
【基本原理】 先用特异性抗体与细胞或组织内相应的抗原结合，洗去未结合的抗体，再用荧光素标记的抗特异性抗体（间接荧光抗体，即荧光素标记的第二抗体）与特异性抗体（第一抗体）相结合，形成抗原－特异性抗体－间接荧光抗体的复合物，此复合物结合有比直接法更多的荧光素。
【主要特点】 本法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素含量增多，发出的荧光亮度强，因而敏感性增强。目前本法应用较广泛，只需制备一种荧光抗体，即可用于多种第一抗体的标记显示。
【染色步骤】
（1）冷冻切片、细胞涂片以冷丙酮固定。
（2）滴加特异性抗体（一抗），37℃，30～60min或4℃过夜，置湿盒中。
（3）PBS洗3次，每次5min。
（4）滴加适当稀释的荧光标记的二抗，37℃，30～60min，置湿盒中。
（5）PBS洗2次，每次5min，蒸馏水洗1次，1min。
（6）50%甘油缓冲液封片。
（7）荧光显微镜下观察。
（8）对照染色。
（三）补体法
【基本原理】 用特异性的抗体和新鲜补体的混合液同时与细胞或组织上的抗原反应，补体将会结合在抗原抗体复合物上，再滴加抗补体的荧光抗体，形成了抗原－抗体－补体－抗补体荧光抗体的复合物。荧光显微镜下所见到的发出荧光的部位即是抗原所在的部位。
【主要特点】 补体法敏感性强，同时适用于各种不同种属来源的特异性抗体的标记显示。该法也可以用来检查组织内免疫复合物的存在情况，常用于肾穿刺组织活检诊断。
【染色步骤】
（1）冷冻切片、细胞涂片以冷丙酮固定。
（2）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，37℃，30min，置湿盒中。
（3）PBS洗3次，每次5min。
（4）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体37℃，30min，置湿盒中。
（5）PBS洗2次，每次5min，蒸馏水洗1次，1min。
（6）50%甘油缓冲液封片。
（7）荧光显微镜下观察。
（8）对照染色：正常血清经56℃，30min处理灭活补体，与特异性抗体溶液等量混合，进行染色。
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