桔梗雄配子体发育异常

在高等植物中雄性不育是一种很普遍的遗传现象，到目前为止已在43科162属297种中发现了雄性不育的存在。不育性是特殊的育种目标性状，通过雄性不育系进行杂交制种，利用杂种优势已成为许多异花乃至自花授粉植物的主要育种方向，不育突变体既可用于育种和群体改良，也是植物生殖生物学和基因组学研究的基础材料。近10年来该领域的分子生物学及基因组学研究取得许多进展，特别是通过育性突变体研究，使人们对植物雌雄配子发育、育性表现的分子机理有了更深入的了解。植物生殖发育直接维系子实产量，因此对植物生殖器官发育遗传及调控机理的阐明将为提高植物育种成效奠定基础。

丰富的种质资源是进行桔梗遗传研究和种质改良的物质基础，具有特异性状桔梗种质的研究鉴定及其遗传信息的占有是科学开展良种培育的前提，随着桔梗种质观察研究的不断深入，一些新的种质类型不断发现。我们于2005—2007年对大量资源材料群体进行不育性的自然变异筛选，对新发现的育性异常种质进行不育性鉴定，分析桔梗自然发生不育性的变异特点，为进一步发掘研究桔梗育性特异种质和利用提供材料及参考。

1　材料与方法

1.1　不育突变材料的发现

2006年7月刘自刚等在进行桔梗去雄杂交、套袋自交的过程中，在当地二年生桔梗栽培群体中发现了1株雄蕊发育异常的桔梗单株，根据其花器、雌雄蕊发育的形态特征，初步判断该单株为雄性不育单株，进一步的花粉染色活力鉴定表明此单株花药虽有少量花粉，但花粉全部败育。随后在种质资源圃及大田中，对桔梗花器形态结构展开了大量的田间观察和花粉活力的鉴定，又相继发现了桔梗不育材料11株，并统一编号为PA-1～PA-12。

1.2　方法

1.2.1　花器观察及雌雄蕊测量

初花期开始，对发现的12株桔梗不育材料进行花器观察和育性鉴定，每隔3天进行1次，随机取当日开放的花1朵，测量花冠大小、子房、雌雄蕊、花药、花丝、花柱、柱头长度和宽度，以相同来源的可育花作为对照。并根据花药着生状态、色泽、花药大小、花粉量等特征，将桔梗育性分为0～3级，其中0级表现为花药干枯瘪小，花药与柱头相离，花药药室中无花粉;1级花药干枯瘪小，花药与柱头相离，花药药室中有微量败育花粉;2级花药瘦小扁平，玉白色，开花后花药紧裹在柱头上，有少量花粉;3级花药长舌状，淡黄色，紧裹柱头，有大量花粉，花药发育正常。

1.2.2　花粉育性鉴定

在开花期每株取5个花药，用解剖针把花药切断将花粉粒挤出，用I2-KI染色，根据染色结果将花粉粒分为3种类型:①典败:花粉粒发育不正常，呈不规则形状，I2-KI染色呈不着色;②圆败:花粉粒六边形，少数椭圆形，I2-KI染色呈黄色;③正常花粉粒:花粉粒五边形，少数六边形，I2-KI染色均匀且为褐色。

1.2.3　柱头活性鉴定

柱头活性检测采用3%H2 O2检测法:于花期从不育单株上分别选择当天开花的新鲜柱头2枚，完全浸泡在3%的双氧水反应液中，如有气泡产生则柱头具有活性，否则无活性;正常花柱头作为对照。

1.2.4　胚珠数目及活性鉴定

从不育单株上选取即将开放的花蕾(花药未开裂)各3朵，固定于FAA中，带回实验室备用。将子房置于载玻片上，细心解剖，将胚珠从胎座中解开，观察并计数，重复3次。胚珠活性测定采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)，取当天开放的花朵，解剖后取出胚珠，浸泡在TTC反应液中，放置在35℃恒温箱中反应15min，然后置于低倍显微镜下观察，有活性胚珠被染成红色，无活性胚珠为无色。

1.2.5　不育株结实率鉴定

于花期对筛选的12个不育单株材料分别进行人工授粉、套袋自交和自然授粉3种处理，并挂牌标记，处理后10d除去套袋。研究中发现桔梗具有自交不亲性，且主要由雌雄蕊异熟和花后柱头绒毛隔离花粉造成，因此采用延迟授粉的方式进行人工授粉，即花前1d套袋，套袋后3d再人工授以新鲜花粉;种子成熟后统计结实率、结籽率。

2　结果与分析

2.1　花形态特征

桔梗可育花花萼钟状，裂片5;花冠阔钟形合生5裂，大小为(2.53～7.77)cm×(3.02～4.57)cm，裂深约1.51cm，花色有紫、白、粉3种，花瓣具清晰脉纹;子房中下位，5室，卵圆形，长约0.96cm，宽0.75cm;柱头棒状紫色，密被白色柔毛;雄蕊5枚紧裹柱头，与花冠裂片互生，长1.62cm，花药黄色4室，长0.78cm，花丝白色，下端膨大成盾片状，长0.84cm，内侧被白色绒毛。桔梗不育花花冠大小、花瓣颜色、子房大小与相同来源的可育花相比没有明显差异;但不育花柱头比可育花略大，色泽也较深为蓝色，柱头外被白色绒毛，无或少有花粉附着;花药干瘪萎缩为灰褐色，与柱头相离，宽仅为可育花花药的1/3，长为2/3左右。

2.2　花粉量、胚珠数和花粉胚珠活性

桔梗可育花单花花粉量为146 880，胚珠数197.6枚，P/O较高，为743.3;可育花粉经I2-KI染色均匀且为褐色，花粉粒正五边形;胚珠与TTC反应被染成深红色，具有较高活性。桔梗不育单株PA-1、PA-3、PA-4、PA-5、PA-6、PA-7、PA-9和PA-11有微量花粉产生，染色镜检后发现花粉外形呈不规则状，不能被I2-KI染色，为典败花粉;PA-6花粉粒能被I2-KI染成浅黄色，花粉外形呈正六边形，为圆败花粉，其余不育单株花药中无花粉产生;不育花单花平均有胚珠203.4枚，比可育花略多，发育正常，且活性与可育花胚珠相当。

2.3　柱头运动及活性

桔梗可育花花蕾刚开放时，柱头被5枚雄蕊紧紧包裹，也有的柱头顶部微露。花后6 h花丝开始逐渐离开柱头。柱头为浅紫色棒状，表面密被白色柔毛，可能是柱头表面细胞壁的突起物。花后1d，柱头白色柔毛开始减少，花后2d被毛消失，柱头表面变得光滑，紫色加深，柱头微裂;花后3d，柱头5裂，裂片向下卷曲，至4d柱头与H2O2反应，仍有大量气泡产生，说明此时柱头活性仍较高;到花后5d时，柱头开始逐渐干萎。不育花花药短小与柱头相离，花药不开裂，柱头深蓝色密被白色绒毛，随后绒毛减少，柱头五裂，但柱头活性保持时间比可育花柱头为长。

2.4　开花物候期

12个桔梗不育单株6月29日至7月6日先后开花，平均单株花期约为45d，开花的次序为植株顶部花蕾最先开放，在分枝上一般也是顶部花蕾先开，单株总花数为50～110朵，平均70朵;单株每天开0～7朵花，通常为1～4朵。单花花期一般为2～3d，当阴天低温可延长至3～4d。夏季晴天，花蕾一般在上午6:00～10:30陆续开放;若遇阴天低温，开花时间延迟到8:00～11:30;也有些花蕾在黎明6:00以前，但很少花蕾在午后开放。

2.5　桔梗不育株的天然传粉

2.5.1　花部特征对传粉昆虫的招引作用

试验设去除雄蕊、去除柱头、去除花冠、吸尽花蜜和完整花(对照)5种处理，检测桔梗花部特征对昆虫的招引作用，结果表明:桔梗花冠对授粉昆虫具有强烈的招引作用，花蜜次之，而柱头和花药对昆虫都没有明显招引作用。去除花冠和吸干花蜜后，授粉昆虫访花频率与对照相比有明显降低，其中去除花冠后昆虫访问频率为0;吸干花蜜处理昆虫访问频率也仅为对照的15.38%，而且访花昆虫在单花上停留时间也明显缩短。与相同来源的可育花相比，桔梗不育花蜜腺、子房均发育正常，花冠、柱头略大，而花药较小，由于花药对授粉昆虫的吸引作用不明显，较小的花药并没有降低不育花对昆虫的吸引力，观察结果表明，不育花与可育花对授粉昆虫具有等同的吸引作用。

2.5.2　访花昆虫

桔梗不育花的访花昆虫及其行为与可育花相同，主要有，土蜂、蜜蜂、熊蜂、木蜂、黄蜂、蝶类、蝇类等十几种昆虫，其中访花频率较高、较稳定的仅有土峰和蜜蜂，熊蜂和木蜂次之，其它访花者少见或偶见。土蜂和蜜蜂采花均从花冠正前方足先落到柱头上，也有少数足先落到花冠内侧，再爬上柱头，然后沿柱头爬到花冠基部，喙管从花丝缝隙间伸入采吸花蜜。土蜂和蜜蜂访花主要目的是采蜜，但偶尔也有采花粉的，这两种传粉者都有良好的授粉效果。土蜂访花一般在单花上停留17.1 s，蜜蜂平均停留18.0 s，这两种蜂一般1次连续访花4～8朵，然后离去。木蜂访花目的是吸取花蜜，一般在单花上停留3.7 s，访花时在花冠内踏足，由于木蜂体型较大，可以较好地给柱头授粉;木蜂采花范围较大，1次一般采7～18朵花。黄蜂偶尔采花，一般在单花上停留2.8 s。蝶类极少访花，访花目的不明确。蛾类偶尔访花，访花时在柱头或花冠上踏足，通过长长的喙管吸食花蜜。食蚜蝇访花目的主要是吸食花冠汁液，踏足位置不固定，一般接触不到柱头，因此授粉的可能性不大。

2.6　不育花结实率

桔梗不育花与正常花人工杂交和自然授粉结果率、结籽率和亲和指数均较高，不育花与相同来源的可育花在结实性上无明显差异;不育花自交不能结籽，桔梗不育花花粉无授粉活力，表明不育花雌蕊正常可育而雄蕊不育，发现的桔梗不育单株确为雄性不育单株(表2-8-1)。

从表2-8-1中还可以看出，桔梗自交和杂交结籽率、亲和指数均较高，表明延迟3d授粉是克服桔梗人工授粉结实率低的有效途径。

表2-8-1　桔梗不育花与可育花结实比较

图2-8-1

1.雄性不育花;2.正常花;3.不育花药、正常花药;4.正常花粉;5.圆败花粉;6.典败花粉

3　讨论

(1)在自然条件下，出现一定频率雄性败育突变体，在高等植物中是一种较为普遍的现象。桔梗的不育种质在吉林、山东已有发现。刘自刚等在2006年7～8月桔梗花期期间，在当地桔梗群体中发现桔梗雄性不育单株12个，对其花粉、柱头、胚珠活性进行了鉴定，并在田间对其进行了不同授粉处理，结果显示不育花无花粉或有微量败育花粉，而柱头、胚珠发育正常，田间授粉结籽率与相同来源的正常花无明显差异，初步判断发现的PA单株为雄性不育突变体材料，这一发现拓宽了桔梗不育种质的遗传基础。

(2)植物与其授粉者的相互作用被认为是被子植物花进化的重要推动力，相互作用表现在花部特征对访花者行为和花粉传递机制的影响［9］。植物花的特征可从两个层次来认识，即花部构成和花的开放式样。花部构成包括花的结构、颜色、气味和蜜汁产量等单个花的所有特征，花的开放式样是指花在某一个时间开放的数量和空间排列，可看作花在群体水平上表现出的特征。而花的招引包括几个同时作用的刺激物:视觉的、嗅觉的和短程的触觉指示;而招引的强度依赖于花的颜色、大小和形状以及挥发物的挥发强度和传粉者的感知［11］。在许多植物中普遍存在不育花花瓣皱缩、蜜腺退化等问题，降低了授粉昆虫访花频率，使不育株系结籽率下降，常造成不育株系的繁种和通过不育系制备杂交种的成本大为增加，成为不育材料广泛利用的不利因素。桔梗不育花花冠、蜜腺、雌蕊均发育正常，与相同来源的正常花相比，对授粉昆虫具有等同的招引作用。花冠对授粉昆虫具有强烈的招引作用，花蜜次之，而花药对昆虫没有明显招引作用。

(3)在对桔梗不育单株开花习性的研究中，观察到PA-5、PA-7和PA-9不育株，同一单株后期开的花比前期开的花败育更为彻底，6月下旬至7月上旬所开不育花有微量花粉，随着气温逐渐上升，到7月下旬所开不育花花药变小，色泽灰褐干枯，仅有微量败育花粉。不育花在温度等环境因子影响下出现微量花粉，在许多作物不育性状表现中也较为常见，这可能是由于花蕾形成过程中气候条件不同造成的;气候上的差异可能使某些控制育性的微效基因对花粉的形成过程产生修饰和干预，导致了较高温度下小孢子发育异常时间的提早，最终造成雄蕊的败育更为彻底。

4　结论

从二年生桔梗群体中发现雄性不育种质PA-1个体，随后对桔梗花器进行了大量田间观察，相继发现桔梗雄性不育单株共12株，统一编号为PA-1～PA-12;对桔梗不育性状表现及特征特性进行初步研究，结果表明:与其相同来源的正常花相比，不育花雄蕊短小、花药干瘪萎缩，色泽为灰褐色;花粉进行I2-KI染色，败育花粉外形不规则，且不能被染色;不育花雌蕊、蜜腺发育正常，花冠略大，对授粉昆虫具有与正常花等同的吸引力;不育花强迫自交结籽率为0，异花人工授粉和天然授粉结籽率与正常花间无明显差异，初步研究结果表明PA单株为雄性不育材料，为桔梗杂种优势的利用开辟了新途径。