全身麻醉剂在细胞水平的作用

对麻醉剂的细胞和分子药理学已有广泛讨论。全身麻醉剂主要可分为两类，用来诱导麻醉的静脉内制剂一般与镇静剂联用，挥发性制剂一般用来维持麻醉。麻醉剂之所以起作用，据认为是由于它对离子通道的作用，即在关键脑区和脊髓调节突触传递及膜电位的那些通道。这些离子通道靶对于麻醉物质的敏感性是有差别的（表15-1）［2］。

表15-1　临床常用麻醉剂的离子机制和作用靶

表改自［2］。

要成为一个全身麻醉剂，药物一定要能够通过血脑屏障，这意味着它一定是相对非亲水性的。这样，麻醉剂往往缺少某些功能基团，例如那些使得许多药物具备特异性而具有与其靶起弱极化力（主要是伦敦分散力，London dispersion force）(1)相互作用的基团，以及某种程度的氢结合力。这些弱相互作用力不可避免地导致麻醉剂效能与药物的无数物理特点之间相当合理的相关性，因为这些物理特点同样取决于介导它们间相互作用的物理力。以前，最具影响的学说是麻醉效能与脂溶性区隔之间的相关，这也就是著名的Meyer-Overton相关。这个相关被解释为：麻醉剂的作用是溶解了神经细胞膜的脂双层，从而改变了神经细胞膜的特性。Meyer-Overton相关现在已经被否定。以后这种理论的许多变异体纷纷被提了出来。但是，这些理论存在的问题很多，既有定量的也有定性的。有一个发现使人们离开脂肪理论，而朝向新的看法，即麻醉剂的作用是由于它直接结合于敏感蛋白质。这个发现是：一个纯粹的溶解性蛋白质——萤火虫的荧光素，它可以受许多化学上简单的麻醉剂的竞争性抑制，而所需的浓度又紧密地反映了动物的麻醉效果。这个实验决定性地转移了麻醉剂作用理论的重点。新理论也解释了脂肪理论所伴随的某些性质上的困难，例如切断效应（cut-off effect）以及它们的温度依赖性［1］。

如果不首先接受这样的事实，即麻醉剂是有选择性地在分子水平起作用，那么，那种认为全身麻醉剂可能作用于特定神经元通路上的观点，将很难被接受。老的观点认为，全身麻醉剂的作用是由于扰乱了细胞膜的脂肪层，或由于某些非特异性机制，但这两种看法都已经过时。现在认为，麻醉剂的作用是通过直接结合到某些蛋白质靶分子（图15-2）。

图15-2　麻醉剂靶的分子性质（彩图见图版此处）

（a）图显示异丙酚优先结合在血清白蛋白的一个非极性囊，在那里与主链羧基形成氢键。（b）图显示氟烷在去铁铁蛋白上的结合位点。氟烷立体选择性地结合于两个4螺旋单聚体界面所形成的非极性缝隙。（c）图表示，有一种简单的看法可以解释麻醉剂在关键靶上面的效应，如GABAA受体。在GABAA受体的动力学方案（图内c下面显示图例等信息的方框）中，在受体运动到开放状态或（脱敏的）关闭状态之前，几乎无例外地有两个分子GABA结合到受体。如果麻醉剂以同样的亲和力结合到这两个状态，那么实验上看到的麻醉剂所有关键效应都可以预测到。这些效应有：长时期的失活延长，但很少有脱敏变化（左小图曲线），GABA浓度-反应曲线平行向左侧移动（中间小图曲线），还有抑制性突触后电位（IPSP）延长（右小图曲线）。（虽然对这些变化可以用人工调节时间常数加以模拟，但这些方案已经没有生理学意义，如果没有明显的麻醉剂结合状态。）（图引自［1］）

迄今为止，有关麻醉剂结合位点的高分辨结构信息仅限于溶解蛋白。现在，一个共识慢慢形成，可以作出几个一般化的解释。第一，麻醉剂优先结合到预先形成的蛋白穴（pre-formed cavity on protein），对蛋白质仅引起很小的局部结构扰动。第二，虽然麻醉剂-蛋白质的结合优先是非极性性质的，但这种结合也牵连极性相互作用，此作用帮助其稳定并使麻醉剂朝向结合位点。在图15-2a，b这两个例子中，麻醉剂引起的蛋白质变化可以忽略（碳原子的平均平方根变化小于0.015 nm）。图像计算应用的软件是PyMol，去铁铁朊-氟烷晶体结构用的软件是1XZ1，血清白蛋白-异丙酚用的软件是1e7a。在与麻醉剂结合以后，蛋白质没有明显的结构重新排列，这一点符合弱相互作用；而最高亲和力的麻醉剂结合位点可以预计是在那样的位置，在那里，麻醉剂把水分子从一个优先非极性的、预先形成的穴中驱赶出来。这提示，麻醉剂并不诱导新的构象状态，而是仅仅结合到预先形成的状态。这样，它们要发挥效应只须简单地移动平衡，使之有利于那种含有麻醉剂结合位点的构型就可以了［1］。

虽然多年来已经研究过大量不同的离子通道、受体、酶以及其他蛋白质，把它们作为推定的麻醉靶分子，但是现有的强力证据表明，直接参与麻醉作用的分子大概仅是少数。首先可以明确地讲，有令人信服的证据表明，有3个靶，它们是麻醉诱导LOC的靶。对这3个靶来说，活体效应可以令人信服地归于离体情况下特定分子的作用。下述是麻醉作用敏感度的某些已知的决定因素（图15-3）［1］。

图15-3　3个关键性的麻醉分子靶

（a）GABAA类型受体：GABAA受体α亚单位（左侧小图）的几个突变体（用☆表示）影响GABAA受体对挥发性麻醉剂的敏感度，受影响氨基酸的侧链可能形成麻醉剂结合空穴。例如，当氨基酸侧链的容积增高时，Ser270替代就减弱了异氟烷的增强作用。与此相伴随的有进行性GABA EC50(2)的减少。当侧链体积增加0.15 nm3时，伴有GABA EC50减少8倍，这可以用自由能的小变化加以解释。如果预计氨基酸埋藏在一个紧密包装的蛋白质分子里面的话，则GABA EC50的上述变化远远小于这种预计。这意味着，Ser270可能位于空穴邻近。β亚单位的突变（中间小图）主要影响静脉注射麻醉剂的效应，但对其他麻醉剂（alfaxalone）也有影响。例如β3的突变N265M消除了异丙酚的增强作用，但不能影响神经甾体阿法沙龙的增强作用（右侧小图）。（b）双孔域钾通道（2PK）：在串联孔域钾通道（tandem pore domain potassium channel，TASK:2PK家族的一员）跨膜域4（TM4）和大的羧基端细胞内域之间的连接区，对于麻醉剂氟烷的激活是关键性的，对于第二信使调制也是关键性的。但可能对信号转导比之对麻醉剂结合更为重要（左侧小图）。对于TASK3通道，TM3突变（M159A）基本上消除了麻醉活性（右侧小图），这个氨基酸可能形成麻醉结合位点的一部分。（c）NMDA受体：NMDA受体在M3（膜域3）及M4的突变，可以减少酒精诱导的这些受体的抑制（右侧及中间小图），也影响受体对吸入性麻醉剂的敏感性（右侧小图）。因为异氟烷及氙抑制受体大部分通过与激动剂甘氨酸的竞争，有可能这些突变体发挥它们的作用是因为它们增加了受体对于甘氨酸的表观亲和力。（图引自［1］）

在中枢神经系统，到处都可以发现GABAA受体。多年来，GABAA受体作为麻醉靶分子的潜在重要性已经被人认识。GABAA受体是超分子家族的一员，这个家族包括乙酰胆碱受体、甘氨酸受体、5-羟色胺受体，其中某些受体也被认为是麻醉的靶。迄今为止，神经元GABAA受体的19种受体亚单位都已经被克隆，但最常见的（＞85%）一种是α1β2γ2，其他形式还有α2β3γ2或α3β（1—3）γ2［1］。

几乎所有全身麻醉剂都被发现能增强GABA诱导的氯电流，一般是在高浓度的时候。当GABA不存在的时候，麻醉剂可以直接作用于GABA受体。只有相对少数的以及非极性的麻醉剂，例如氙和环丙烷（cyclopropane），这两者对GABAA受体的作用很小或者没有作用。全身麻醉剂对GABAA受体作用的功能效应，依赖于受体亚单位的组成，由于亚单位敏感性的固有差别，或由于不同受体的生物物理学特征，还有它们在细胞膜表面分布的不同。GABAA受体除了在突触部位成簇以外，大量受体分布在突触外区，在那里，它们暴露在波动着的但低浓度的GABA作用之下。此群GABAA受体贡献于所谓的“张力性抑制”。突触部位的优先GABAA受体类型似乎是α（1—3）β2/3γ2，而含有α（4—6）（α4βxδ、α5βxγ2和α6βxδ）的受体优先地或唯一地分布于突触外区。麻醉剂对这些突触外受体有相当的效应。一般认为，这些受体对GABA有高亲和力，而且缺少脱敏现象。突触外电流增强的百分比，较之突触电流增强的百分比要大，可能是由于受体亚单位的差别，或由于体液中GABA浓度的不同。然而，有关麻醉剂对于活体起何作用，以及到底张力性及位相性抑制的相对贡献如何，仍有待于研究（详见第4章）［1］。

人们研究GABAA受体作为麻醉剂的靶，其重要推动力之一来自一些实验。这些实验发现，特定突变可以去除或大大减轻GABA麻醉的敏感性。有大量文献报道，特定的GABAA受体点突变影响GABAA受体对全身麻醉剂调制作用的反应。这些研究特别重要，如果某一特定突变仅影响麻醉调制（不影响其他通道特征），就有可能把“静默”突变引入小鼠，以此来测定该受体对于活体麻醉剂表型的影响如何［1］。

因为麻醉剂的结合增强了GABA的作用，所以任何麻醉剂结合位点应该紧密地耦合于受体门控。因此，为了鉴定一个麻醉剂的结合位点，也需要用突变来进行研究。有一个策略是测定在半胱氨酸残基突变后硫氢基试剂反应的变化，再看看在麻醉剂存在和不存在的条件下反应有何区别。应用这种研究途径，有实验显示，在异丙酚（propofol）存在条件下，可以把甲硫氨酸286（Met286）保护起来，不让它标记。这就提示，Met286可能是结合囊的一部分。更直接的研究方法使用了光反应性的麻醉剂。一个光反应性甲苄咪唑（etomidate）类似物标记了β亚单位的Met286以及α亚单位的Met236。这个光反应实验提示，在α-β亚单位界面上有一个麻醉剂结合位点，而在α-δ界面上有苯二氮卓的相等位点。这是一条有希望的研究途径，但技术上比较困难，由于能提供的受体数量较少，也由于标记水平较低。其原因是标记可以发生在其他某些氨基酸上，而那些氨基酸被标记是远远优先的［1］。

已经发现，GABAA受体亚单位的几个突变体可以调制麻醉的作用。在α亚单位上面的，可以减少或者消除挥发性麻醉剂的效应，但对于静脉注射的麻醉药物很少有作用；而在β亚单位上的位点，可以减少静脉麻醉及挥发性两者的作用。β3的N265M突变可以大大降低甲苄咪唑（etomidate）、异丙酚（propofol）和戊巴比妥使动物的翻正反射丧失的能力，并基本上消除对于疼痛刺激的反应能力；但这种突变对于羟-5α-孕烷二酮、阿法沙龙（alphaxalone，静脉麻醉剂）、氟烷（halothane）或安氟醚（enflurane）没有作用或作用很小。后来的工作显示，突变对于由甲苄咪唑引起的运动反应的减少没有效果。类似的小鼠研究用同等β2亚单位N265S突变，发现突变的最大效果是针对甲苄咪唑引起镇静及LORR的能力；而较少影响甲苄咪唑减少动物对疼痛刺激的反应。有意思的是，β2N265S基因敲入动物（以及在较小程度上，β3N265M基因敲入动物）对甲苄咪唑诱导的体温降低较不易感受。由于负责调节体温的主要神经元位于下丘脑前部，而那个脑区也参与调制自然睡眠，这很可能反映麻醉效果对于重叠的神经元通路有作用（见后）［1］。

把α1亚单位双基因敲入小鼠（S270H及L277A）工程化以保持其对GABA的敏感性不受扰乱，这种小鼠显示对挥发性麻醉剂LORR的敏感性变化，此结果支持含α1的GABAA受体介导麻醉剂效应。经修饰的活性类似于含α1的GABAA受体的离体活性［1］。

虽然人们不可避免地会关心，基因敲除动物有代偿的问题，但最近有两项基因敲除实验应用了α4、α5基因敲除动物，显示了令人感兴趣的明确结果。这些结果强有力地链接了特定麻醉剂或镇静剂表型与突触外GABAA受体之间的关系。α4亚单位被认为优先定位在突触外区，当对缺少α4亚单位的小鼠应用加波沙朵（gaboxadol，镇痛药）时，动物缺少步态不稳、镇静和镇痛的反应，而加波沙朵是选择性地靶向突触外区GABAA受体的。在第二个实验中，α5亚单位主要存在于突触外区，缺少α5亚单位的小鼠不显示甲苄咪唑对LORR的效应，却能够显示甲苄咪唑对记忆损失恢复的效应（当它跟野生型小鼠进行比较时）［1］。

毫无疑问，GABAA受体在麻醉剂引起的LOC中起重要作用，但是它们对某些全身麻醉剂很显然地更为重要，比之对另一些全身麻醉剂。最令人信服的资料来自一些应用基因修饰动物的实验，发现在活体动物上看到的和离体看到的立体选择性，与GABAA受体有密切相关。这种结果也提供了强的支持性证据，说明GABAA受体与麻醉诱导的LOC之间有因果性联系［1］。

钾通道被麻醉剂开放，这早就被考虑是一个可能的重要问题。现在有越来越多的证据表明，钾通道至少介导挥发性麻醉剂的某些效应。受麻醉剂激活的钾通道，首先是在软体动物椎实螺属（Lymnaea）中被特征化的，而新型钾通道以后在哺乳动物中也找到了。某些哺乳动物的钾通道可被挥发性麻醉剂所激活，此现象使得这些钾通道成为潜在的关键分子靶。双孔域钾通道（2PK）被认为对神经元兴奋性提供了基础调制。现在知道，2PK至少有15种不同亚单位，而功能通道由双聚体组成，可以是同聚体也可以是异聚体。这个通道家族的5个成员（TREK1、TREK2、TASK1、TASK3、TRESK）可以直接被挥发性全身麻醉剂所激活［1］。

这些通道的麻醉剂敏感性不是均匀的，虽然所有5种通道都对氟烷敏感，但异氟烷和氯仿的效应是可变的，其中TASK1很少受乙醚的影响。小分子麻醉剂——氙、一氧化氮（NO）、环丙烷（cyclopropane）都展示选择性，它们都激活TREK1通道，但对于TASK3没有明显效应。2PK通道异二聚体为解释2PK通道麻醉剂的敏感性提供了进一步的变异性。临床应用的静脉注射麻醉剂，没有一种被显示可以受2PK通道的影响，2PK通道只对挥发性麻醉剂起反应［1］。

一般说来，2PK通道的麻醉剂激活可以抑制神经元活性，或由于膜超极化，或由于增加膜电导，从而减少兴奋性电流的效果。然而，这些通道也存在于突触前，而且它们在突触前的激活可以是抑制性的（如果是兴奋性突触），也可以是兴奋性的（如果是抑制性突触）［1］。

与GABAA受体相比，对于2PK通道麻醉剂敏感性的决定因素知道得很少。就TREK1通道而言，它的大的羧基端域显然对于麻醉剂敏感性是重要的（对其他的调制性影响也是如此）；但TASK通道的大的羧基端域仅产生很小的作用。把此通道的跨膜轴心区连接到大胞质区的C末端域区域，具有关键性的意义。此区域中具有6个氨基酸（238-VLRFLT-243）的一段，被显示对于麻醉剂激活TASK通道是必需的，后来又被显示对于通过神经递质介导和第二信使调制的通道关闭同样是重要的。类似地，位于TREK1C末端开始部分的谷氨酸306（Glu306），被发现对于TREK通道门控起关键作用。Glu306突变导致组成型的通道的活动，这种通道大部分对于调制性控制不敏感，包括对麻醉剂的激活。根据已有证据，事情看来是这样的：在大的羧基端域前面的C末端域以及短的链接区，对于麻醉效应的转导是重要的，但这些区不见得参与麻醉剂的结合。近来，人TASK通道第三跨膜域（TM3）的M159A突变显示，此种突变取消了麻醉剂对通道激活的效应（图15-3b）。另有事实显示，软体动物椎实螺属2PK、TASK通道的等价突变，扰乱了异氟烷的立体选择性效应。这个事实提示，此氨基酸残基是在麻醉剂的结合位点上［1］。

有关麻醉剂作用于2PK通道和作用于动物身上的效应这两者关系的直接证据还比较少，但特别令人信服的是TREK通道。对于一系列挥发性麻醉剂诱导痛觉反应消失的指标，TREK1基因敲除小鼠展示了程度上明显的减轻；而在较小程度上，LORR也减轻了。当与野生小鼠比较时，TASK基因敲除小鼠的麻醉剂敏感性小量降低。重要的是，TREK敲除小鼠对巴比妥类药物的敏感性并不显示什么变化（此药并不激活TREK）。这提示，并没有出现代偿性GABAA受体上调。然而，功能性代偿经常会在基因敲除动物中出现。因此，对于2PK通道在麻醉中所起的作用，仍然需要提供进一步的证据，这样才能清楚地确定此问题［1］。

突触后的谷氨酸受体分为两大类，一类是NMDA受体。另一类是非NMDA受体。后者又分为两种，一种叫AMPA受体，另一种叫红藻氨酸受体，这些受体介导兴奋性突触电流的快速成分，但都没有麻醉敏感性。相反，介导突触传递慢成分的NMDA受体在突触前和突触外区存在。NMDA受体可能是某些麻醉剂的重要靶点。NMDA受体含有必需的NR1亚单位，以及至少4个NR2亚单位A—D中的一个。还有两个NR3亚单位以及无数剪切变异体。这种异源性的存在给予了NMDA受体以动力学、药理学和解剖学上丰富、全部的变异性［1］。

多数吸入性麻醉剂在某种程度上抑制NMDA受体，虽然对“程度”的估计差别还很大。对NO和氙有特定的聚焦，部分原因是这两个麻醉剂很少或没有对GABAA受体的作用，第二个原因部分地是它们与NMDA受体拮抗剂例如氯胺酮有某些共性，例如能够诱导明显的镇痛及拟精神病效应。NO和氙都能够强有力地减弱脊髓NMDA受体介导的传递并且提供神经保护作用，这是NMDA受体拮抗剂的另一个特点［1］。

已经报道了减少NMDA受体麻醉敏感性的两种突变体（NR1的F639A及NR2A的A825W），但其作用因不同麻醉剂而有很大变异。有人发现，氙和异氟烷可以竞争基本的共拮抗剂——甘氨酸，甘氨酸也结合到NR1亚单位，而且F839A突变可能由于增加了NMDA受体对甘氨酸的表观亲和力而发挥作用。这提示，麻醉剂对于NMDA受体的麻醉性抑制，至少部分地依赖于局部的甘氨酸浓度，这就可以解释某些文献上有关这些受体参与麻醉敏感性的不同报道［1］。

有许多选择性NMDA受体拮抗剂在高浓度时都可引起镇静，然后引起LOC或LORR作用；但是有些选择性药物在浓度增高时，经常会募集更多靶点。氯胺酮的情况很可能就是如此，已经知道它可以影响许多其他受体。然而，离体和活体的立体选择性情况提示，NMDA受体仍然可能是氯胺酮的一个重要靶。应该想到的另一件事情是，由NMDA受体拮抗剂所引起的LOC或LORR，通常在它们发生之前伴有行为异常。例如就氯胺酮而言，LOC在人体上引起的最后状态，更类似于一种全身僵硬症的昏迷，并伴有某种型式的脑活动，而这又与其他全身麻醉剂所引起的情况很不相同。虽然有这种可能：NMDA受体拮抗性在NO、氙的麻醉效应方面起一定作用，特别是它们的镇痛效果，从某种意义上看，也包括其他挥发性麻醉剂，但可能还需要额外的靶才能解释，一氧化氮、氙何以能够引起LOC［1］。

除上述3个靶以外，看起来似乎有道理作为靶来看待的还有数个其他值得一提的分子。第一个是甘氨酸受体，它与GABAA受体同源并与之共存，它是一个潜在的麻醉靶。甘氨酸受体有抑制性作用，特别在下位脑干和脊髓，在那里甘氨酸受体可能介导挥发性麻醉剂的作用。第二个是超极化激活核苷酸门控阳离子通道（HCN）。它实现超极化激活的阳离子电流（Ih），是一个潜在的麻醉作用靶。这种通道在整个脑内都有发现，但很少有人研究其麻醉敏感性。已有的证据显示，它们真的在脑干运动神经核内引起某些挥发性麻醉剂的敏感性，并在丘脑-皮层神经元中造成对异丙酚（propofol）的相当敏感性。异丙酚引起的抑制在丘脑-皮层神经元中是相当高程度的，比之它在海马或延髓的神经元中。这很可能是由于不同受体亚型敏感性的关系，而特别令人感兴趣的是，由于Ih电流在调制丘脑-皮层振荡频率方面起关键性作用［1］。

最后，虽然麻醉效应对多数电压门控通道仅有很小的作用，但是挥发性麻醉剂对某些钠通道亚型的突触前抑制，可以用来解释某些在谷氨酸突触中发现的抑制［1］。

目前还很少神经肽与麻醉剂作用关系的报道，但神经肽对睡眠-觉醒转变的影响，是近年来备受关注的问题。首先，作为对环境及内部刺激的反应，神经肽代表生理状态，如能量水平或应激；其次，神经肽可以兴奋或抑制靶神经元，以诱导、稳定或转变睡眠-觉醒状态。因此，神经肽整合某些生理亚系统，例如昼夜节律时间、能量代谢稳态、应激、生长状态等，以产生合适的睡眠-觉醒状态［3］。

神经肽的具体作用为：①在睡眠-觉醒中枢的调节方面，有下丘脑泌素促进觉醒和压抑REM睡眠，黑色素浓集激素（MCH）对抗下丘脑泌素的作用，从而促进REM睡眠，强啡肽调制下丘脑泌素神经元，因此可能影响睡眠，垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating peptide，PACAP）调节REM睡眠和觉醒，转化生长因子α（transforming growth factorα，TGFα）和表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）介导对运动活性的昼夜节律影响；②在能量代谢稳态和睡眠方面，有瘦素促进睡眠，生长激素释放肽、胆囊收缩素、神经肽Y（NPY）对睡眠-觉醒调节产生广泛作用，可卡因-苯异丙胺调节转录物（CART）可能促进睡眠；③在应激与睡眠方面，有促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）调节REM睡眠，泌乳素（prolactin，PRL）可能促进REM睡眠；④在与生长、修复、防御相关的肽与睡眠方面，有促生长激素和促生长激素释放激素促进睡眠、生长激素抑制素和皮层稳定肽（cortistatin）对睡眠具有相反作用，脑源性神经营养因子（BDNF）调制NREM睡眠，TNF和IL-1β促进睡眠［3］。