光遗传学探针技术的改进

光遗传学方法的优点是，它有可能选择性地激活特定、特异的神经元群，或选择性地激活分泌特定神经递质的神经元群，但是为了做到这一点，还有许多需要解决的问题［1］。

野生型视蛋白的活动特征往往不能满足神经元活动特点的需要，应用构建突变体的方法以改进视蛋白探针的性能，有可能使视蛋白激活所产生的活动尽可能接近生理条件下神经元的激活型式［1］。

前已述及，最近应用ChR就获得了神经元的快速兴奋，改进野生型ChR以获得满足不同需要的突变体，其目的之一就是提高光兴奋的频率，因为活体的许多类型的神经元，在生理条件下必须进行高频率的动作电位发放，大于40 Hz。比如有些表达小清蛋白（parvalbumin，PV）的、快速放电的抑制性中间神经元，它们被认为参与脑区间神经元的振荡和同步化放电。如果放电频率达不到，或者不能超过40 Hz，用这类蛋白质转染神经元就达不到模拟正常生理活动的目的。于是，就要设法对ChR2进行突变［1］。

野生型ChR如ChR2，其光电流失活时间常数（τ）为10 ms左右［1］。如果修饰ChR2分子，使123位的谷氨酸残基突变成苏氨酸或丙氨酸，就可以加速通道动力学，τ从10 ms降低到4 ms，于是放电频率可以加快。这一变化相当明显地增加了快速光遗传学调控的可控性。调控频率可达4 ms的倒数，即每秒250次左右［1］。

另一群突变体也值得注意，它们是激活波长红移的嵌合体——ChR1/VChR1家族（C1V1），这是一种比VChR1（volvox通道视紫质1，或称团藻通道视紫质1）强4倍的红移视蛋白。有了这些嵌合体，就增加了联合应用去极化或兴奋的可能性［7］。

为了延长光周期，可以对ChR2进行突变，获得具双态行为的视蛋白。方法是产生独特的128位半胱氨酸［5］及156位天冬氨酸突变。这两个位置突变以后，ChR的光周期明显延长。野生型ChR2的电导，其τ大概是光停止以后10 ms，如果ChR2的128位从C（半胱氨酸）变成其他氨基酸（X），τ就变成长得多，例如在C128T（苏氨酸）、C128A（丙氨酸）、C128S（丝氨酸）等的突变体上，其光电流衰减的τ可以长得多，分别达到2 s、42 s、100 s。这种突变的视蛋白被称为步态功能视蛋白（step-function opsin，SFO），因为它能够维持双态，能够步态样调控神经元膜电位的激活与失活，从而使细胞处于接近动作电位发放之阈值水平，可以增加内源性突触输入引起锋电位的概率［1］。

应用额外的以及组合性的突变，以后又发展了其他SFO蛋白，其失活时间常数可长达30 min。应用这种稳定的SFO（steady SFO，SSFO），从原理上说，被靶向的神经元可以步态化（stepped）到静息电位水平的稳定去极化。在此条件下，如果把光源移掉，应该能够发生如同在生理学实验中所遇到的那种行为。此时，完全没有光，也不需要其他硬件配备［1］。