食品中苏丹红染料(

高效液相色谱法(GB/T19681—2005)适用于食品中苏丹红染料Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的检测。

1.原理

样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。

2.试剂与标准品

①色谱纯: 乙腈、丙酮;

②分析纯: 甲酸、乙醚、正己烷、无水硫酸钠;

③层析用氧化铝(中性100目～200目): 105℃干燥2h，于干燥器中冷至室温，每100 g中加入2m L水，混匀后密封，放置12h后使用。

注: 不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1μg/m L的苏丹红的混合标准溶液1m L加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60m L完全洗脱为准，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红Ⅲ的回收率偏低时表明活性偏高。

④5%丙酮的正己烷液: 吸取50m L丙酮用正己烷定容至1L。

⑤标准物质: 苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ; 纯度≥95%。

⑥标准贮备液: 分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各10.0mg(按实际含量折算)，用乙醚溶解后用正己烷定容至250m L。

⑦样品制备: 将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需磨细。

3.仪器与设备

层析柱管: 1cm(内径) ×5cm(高)的注射器管。

氧化铝层析柱: 在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10m L正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。

高效液相色谱仪(配有紫外可见光检测器)。

分析天平: 感量0.1mg; 旋转蒸发仪; 均质机; 离心机; 0.45μm有机滤膜。

4.操作方法

1)样品处理

(1)红辣椒粉等粉状样品

称取1～5g(准确至0.001g)样品于三角瓶中，加入10～30m L正己烷，超声5min，过滤，用10m L正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5 m L以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10～30m L正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60m L洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5m L，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。

(2)红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品

称取0.5～2g(准确至0.001g)样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解(1～10m L)，难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。后续按(1)中“慢慢加入到氧化铝层析柱中……待测”操作。

(3)辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品

称取10～20g(准确至0.01g)样品于离心管中，加10～20m L水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30m L正己烷:丙酮(3+1)，匀浆5min，3000rpm离心10min，吸出正己烷层，于下层再加入20m L×2次正己烷匀浆，离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5分钟，用5m L正己烷溶解残渣后，按(1)中“慢慢加入到氧化铝层析柱……过滤后待测”操作。

(4)香肠等肉制品

称取粉碎样品10～20g(准确至0.01g)于三角瓶中，加入60m L正己烷充分匀浆5min，滤出清液，再以20m L×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5m L以下，按(1)中“慢慢加入到氧化铝……待测”操作。

2)色谱条件

(1)仪器条件

色谱柱: Zorbax SB-C183.5μm4.6mm×150mm(或相当型号色谱柱); 流动相:溶剂A(0.1%甲酸的水溶液:乙腈=85 15); 溶剂B(0.1%甲酸的乙腈溶液:丙酮=80 20); 梯度洗脱: 流速:1m L/min柱温:30℃检测波长: 苏丹红Ⅰ478nm; 苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ520nm; 于苏丹红Ⅰ出峰后切换。进样量10μL。梯度条件见表12-5。

表12－5 梯度条件

(2)标准曲线

吸取标准储备液0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6m L，用正己烷定容至25m L，此标准系列浓度为0，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56μg/m L，绘制标准曲线。

3)计算

R=C×V/M (12-11)

式中: R——样品中苏丹红含量，单位为毫克每千克(mg/kg);

C——由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为微克每毫升(μg/m L);

V——样液定容体积，单位为毫升(m L);

M——样品质量，单位为克(g)。

4)苏丹红标准色谱图

见图12-7。

图12－7 苏丹红标准色谱图