可溶性和不溶性膳食纤维的测定

1.原理

取干燥试样，经α-淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解消化，去除蛋白质和淀粉，酶解后样液用乙醇沉淀、过滤，残渣用乙醇和丙酮洗涤，干燥后物质称重即为总膳食纤维残渣; 另取试样经上述三种酶酶解后直接过滤，残渣用热水洗涤，经干燥后称重，即得不溶性膳食纤维残渣; 滤液用4倍体积的95%乙醇沉淀、过滤，干燥后称重得可溶性膳食纤维残渣。以上所得残渣干燥称重后，分别测定蛋白质和灰分。总膳食纤维、不溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维的残渣扣除蛋白质、灰分和空白即可计算出试样中总的、不溶性和可溶性膳食纤维的含量。

本法测定的总膳食纤维是指不能被α-淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解消化的碳水化合物聚合物，包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶等; 一些小分子的可溶性膳食纤维，低聚果糖、低聚半乳糖、多聚葡萄糖等，由于能部分或全部溶解在乙醇溶液中，用本方法不能准确测量。

2.试剂

95%乙醇(分析纯)，α-淀粉酶溶液，蛋白酶，葡萄糖苷酶，酸洗硅藻土，重铬酸钾洗液，MES［2-(N-吗啉代)乙烷磺酸］，TRIS(三羟甲基氨基甲烷)，0.05mol/LMES-TRIS缓冲液，3mol/L乙酸溶液，0.4g/L溴甲酚绿溶液，石油醚，丙酮。

3.仪器

①高型无导流口烧杯: 400m L或600m L。

②坩埚: 具粗面烧结玻璃板，孔径40～60μm(国产型号为G2坩埚)。

坩埚预处理: 坩埚在马福炉中525℃灰化6h，炉温降至130℃以下取出，于洗液中室温浸泡2h，分别用水和蒸馏水洗干净，最后用15m L丙酮冲洗后风干，加入1.0g硅藻土， 130℃烘至恒重，取出坩埚，在干燥器中冷却1h，称重，记录坩埚加硅藻土质量，精确到0.1mg。

③真空装置: 真空泵或有调节装置的抽吸器。

④振荡水浴: 有自动“计时-停止”功能的计时器。

⑤分析天平: 精确到0.1mg。

⑥马福炉: 能控温525℃±5℃。

⑦烘箱: 105℃，130℃±3℃。

⑧干燥器: 二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂每两周130℃烘干过夜一次。

⑨p H计: 具有温度补偿功能，用p H值4.0，p H值7.0，p H值10.0标准缓冲溶液校正。

4.样品制备与酶解

1)样品制备

样品处理时若脂肪含量未知，膳食纤维测定前应先脱脂。

①将样品混匀后，70℃真空干燥过夜，然后置于干燥器中冷却，干样粉碎后过0.3～0.5 mm筛。

②若样品不能受热，则采取冷冻干燥后再粉碎过筛。

③若样品中脂肪含量＞10%，正常的粉碎困难，可用石油醚脱脂，每次每克试样用25m L石油醚，连续3次，然后再干燥粉碎，要记录由石油醚造成的试样损失，最后在计算膳食纤维含量时进行校正。

④若样品含糖量高，测定前要先脱糖处理，按每试样加85%乙醇10m L处理样品2～3次，40℃下干燥过夜。

⑤粉碎过筛的干样存放于干燥器中待测。

2)试样酶解

每次分析试样要同时做2个试剂空白。

①准确称取双份样品(m1和m2)1.0000g±0.0020g，把称好的试样置于400m L或600 m L高脚烧杯中，加入p H值为8.2的MES-TRIS缓冲液40m L，用磁力搅拌直至试样完全分散在缓冲液中(避免形成团块，试样和酶不能充分接触)。

②热稳定α-淀粉酶酶解: 加50μL热稳定α-淀粉酶溶液缓冲搅拌，然后用铝箔将烧杯盖住，置于90℃～100℃的恒温振荡水浴中持续振荡，当温度升至95℃时开始计时，通常总反应时间35min。

③冷却: 将烧杯从水浴中移除，冷却至60℃，打开铝箔盖，用刮勺将烧杯内壁的环状物以及烧杯底部的胶状物刮下，用10m L蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。

④蛋白酶酶解: 在每个烧杯中各加入(50mg/m L)蛋白酶溶液100μL，盖上铝箔，继续水浴振摇，水温达60℃时开始计时，在60℃±1℃条件下反应30min。

⑤p H值测定: 30min后，打开铝箔盖，边搅边加入3mol/m L乙酸溶液5m L。溶液在60℃大调p H值约至4.5(以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂)。

注: 一定要在60℃时测p H值，温度低于60℃ p H值升高，每次都要检测空白的p H值，若所测值超出要求范围，同时也要检查酶解液的p H值是否合适。

⑥淀粉葡萄糖苷酶酶解: 边搅拌边加入100μL淀粉葡萄糖苷酶溶液，盖上铝箔，持续振摇，水温到60℃时开始计时，在60℃±1℃条件下反应30min。

5.测定

1)总膳食纤维的测定

①沉淀: 在每份试样中加入预热至60℃的95%乙醇225m L(预热以后的体积)，乙醇与样液的体积比为4 1，取出烧杯，盖上铝箔，室温下沉淀1h。

②过滤: 用78%的乙醇15m L将称重过的坩埚中的硅藻土润湿并铺平，抽滤去除乙醇溶液，使坩埚中硅藻土在烧结玻璃板上形成平面。乙醇沉淀处理后的样品酶解液倒入坩埚中过滤，用刮勺和78%的乙醇将所有残渣转至坩埚中。

③洗涤: 分别用78%乙醇、95%乙醇和丙酮15m L洗涤残渣各2次，抽滤去除洗涤液后，将坩埚连同残渣在105℃烘干过夜。将坩埚置于干燥器中冷却1h，称重(包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土)，精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻的干重，计算残渣质量。

④蛋白质和灰分的测定: 称重后的试样残渣，按GB/T5009.5的规定测定氮含量，以氮含量×6.25为换算系数，计算蛋白质质量; 按GB/T5009.4测定灰分，即在525℃灰化5h，于干燥器中冷却，精确称重坩埚总质量(精确至0.1mg)，减去坩埚和硅藻土质量，计算灰分质量。

2)不溶性膳食纤维的测定

①按上述“试样酶解”操作中所述方法进行取样和酶解，将酶解液转移至坩埚中过滤。过滤前用3m L水润湿硅藻土并铺平，抽取水分使坩埚中的硅藻土在烧结玻璃板上形成平面。

②过滤洗涤: 试样酶解液全部转移至坩埚中过滤，残渣用70℃热蒸馏水10m L洗涤2次，合并滤液，转至另一600m L高脚烧杯中，备测可溶性膳食纤维。残渣分别用78%乙醇、95%乙醇和丙酮15m L各洗涤2次，抽滤去除洗涤液，并按“1)总膳食纤维的测定③洗涤”洗涤干燥称重，记录残渣质量。

③按上述“总膳食纤维的测定”中所述方法测定蛋白质和灰分。

3)可溶性膳食纤维测定

①计算滤液体积: 将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600m L高型烧杯中，通过称“烧杯+滤液”总质量、扣除烧杯质量的方法估算滤液的体积。

②沉淀: 滤液加入4倍体积预热至60℃的95%乙醇，室温下沉淀1h。以下测定按“总膳食纤维测定”步骤②～步骤④进行。

6.结果计算

①空白的质量按式(8-26)计算:

式中: m B——空白的质量，单位为毫克(mg);

m BR1和m BR2——两份空白测定的残渣质量，单位为毫克(mg);

m PB——残渣中蛋白质的质量，单位为毫克(mg);

m AB——残渣中灰分的质量，单位为毫克(mg)。

②膳食纤维的含量按式(8-27)计算:

式中: X——膳食纤维的含量，单位为克每百克(g/100g);

m BR1和m BR2——两份试样残渣的质量，单位为毫克(mg);

m——试样残渣中蛋白质的质量，单位为毫克(mg);

m A——试样残渣中灰分的质量，单位为毫克(mg);

m B——空白的质量，单位为毫克(mg);

m1和m2——试样的质量，单位为毫克(mg)。

计算结果保留到小数点后两位。

总膳食纤维(TDF)、不溶性膳食纤维(IDF)、可溶性膳食纤维(SDF)均用式(8-27)计算。