吸光光度－化学计量学分析方法测定饮料中混合色素各组分

时间：2023-02-13 理论教育版权反馈

【摘要】：绘制饮料中混合色素的紫外可见光谱，获得相关色素的浓度信息。各国相继制订了法规，淘汰了大部分有毒性的化学合成色素，并对食品中合成色素的使用做了限量规定。目前大多采用色谱法来测定饮料中混合色素的含量。对吸收光谱相互重叠的多组分体系，运用化学计量学方法不经物质分离，就可对其各组分同时进行定量分析。其次，用美年达橙汁饮料作为未知样，依照同样的方法进行分析，测定饮料中的柠檬黄、日落黄、胭脂红3种色素的含量。

实验11　吸光光度－化学计量学分析方法测定饮料中混合色素各组分

一、目的

绘制饮料中混合色素的紫外可见光谱，获得相关色素的浓度信息。学会对紫外可见光谱图进行化学计量学方法的处理，掌握通用标准加入法（GSAM）的测量原理和定量计算方法。

二、内容提要

20世纪初，毒理学的发展发现了当时许多用于食品、饮料的化学合成色素有不同程度的毒性，有的甚至可致癌。各国相继制订了法规，淘汰了大部分有毒性的化学合成色素，并对食品中合成色素的使用做了限量规定。

根据国家标准GB10789－1996《软饮料的分类》，碳酸饮料是在糖液中加入果汁（或不加果汁）、酸味剂、色素及食用香精等制成的调和糖浆，然后加入碳酸水而制成。饮料中常用的人工合成色素有以下几种。

（1）柠檬黄（酒石黄，Tartrazine）

柠檬黄是3－羧基－5－羟基－1－（对磺苯基）－4－（对磺苯基偶氮）邻氮茂的三钠盐，属单偶氮类色素。分子量534.39，结构式如下：

其外观为橙黄色粉末，无臭，易溶于水、甘油、丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂。λ_max为426nm，最大使用量0.1g·（kg）^－1。

（2）日落黄（Sunset Yellow）

日落黄是1－（对磺酸苯基偶氮）－2－萘酚－6－磺酸二钠盐，属单偶氮类色素，分子量452.37。结构式如下：

其外观为橙红色粉末，无臭，易溶于水、甘油、丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂。λ_max为482nm，最大使用量0.1g·（kg）^－1。

（3）胭脂红（丽春红4R，Ponceau 4R）

胭脂红是1－（4′－磺基－1′－萘偶氮）－2－萘酚－6，8－二磺酸的三钠盐，属单偶氮类色素，分子量604.50。结构式如下：

其外观为红色粉末，无臭，易溶于水、甘油，微溶于乙醇和乙二醇－乙醚混合溶液。λ_max为508nm，最大使用量0.05g·（kg）^－1。

紫外－可见分光光度法，由于其简单、快速、准确及重复性好等特点，在许多领域均有广泛的应用。但饮料中混合色素含量的测量属于多组分体系。对于多组分复杂体系，如需用分光光度法来测量，传统的方法是采用掩蔽或化学分离的办法将其简化为单组分体系，往往较为繁琐复杂，容易引入较大误差。目前大多采用色谱法来测定饮料中混合色素的含量。

现代分光光度计可以从一个样品得到全波段范围内不同波长处的吸光度值，把它与化学计量学（Chemometrics）相结合，可充分利用大量的信息。对吸收光谱相互重叠的多组分体系，运用化学计量学方法不经物质分离，就可对其各组分同时进行定量分析。

化学计量学是20世纪70年代发展起来的一门化学分支学科，它是一门应用数学和统计学方法，设计和选择最优的测量过程和实验方法，并通过对化学数据的解析，以获得更多化学信息的学科。在多组分复杂体系的分析中，由于组分信号之间的重叠，我们无法找到单个测量数据与某一个组分之间的对应关系，此时，我们可以使用多元校正的化学计量学方法来解决。

通用标准加入法（Generalized Standard Addition Method，GSAM）是一种多元校正的化学计量学方法，这种方法能有效地克服基体效应，同时校正得到各组分含量。此外，对校正仪器漂移等也具有重要作用。

通用标准加入法是在待测样品中按照正交设计直接多次加入多种待测标准物，从而构成一测量矩阵，并在此基础上进行多元校正的定量计算。

设有一待测试样，含有n个组分，各组分的初始浓度为c_0i（i＝1，2，…，n），向此试样进行m次标准加入，每加入一次后，测量试样在p个波长处的吸光度值，这样就得到一测量矩阵A_m×p

式中A_m×p表示m行p列的吸光度矩阵；C_m×n为m行n列的浓度矩阵；B为第n个待测组分在第p个波长处的吸光系数矩阵；E是测量误差矩阵。

同理，未加入标准物质的待测试样也可以构成一个每列相同的A₀矩阵

式中C₀可看作一个每列相同的矩阵，即每列都由c₀构成。应该指出，必须使原待测试样的体积保持不变（即加入小体积的较浓标准溶液）或采用稀释至相同体积的方法，C₀才可看作一个每列相同的矩阵。

式（4－9）、式（4－10）两式相减，可得

式中ΔA为吸光度增量组成的矩阵，可由实验结果计算得到；ΔC表示m次加入后的溶液中n个待测组分的浓度增量矩阵，是由分析者人为设计所构成的，这个矩阵必须进行正交设计，以使各次加入的标准溶液浓度线性无关，否则会由于矩阵ΔC的病态导致预报失败。因此实验设计在GSAM中很重要。采用最小二乘法可由式（4－11）求得B_n×p

式中上角t及－1指该矩阵的转置及求逆。

求得B矩阵后，根据原始试样在p个波长处的吸光度值A₀，可计算出试样中各组分的初始浓度

实验数据的处理可采用软件MATLAB（Matix Laboratory）来进行（软件简介见附录）。

在本实验中，首先，配制与美年达橙汁饮料含有相同色素的模拟样，用紫外－可见分光光度计测绘吸收光谱图并采集数据，使用MATLAB软件分析所得数据，测定方法的回收率。其次，用美年达橙汁饮料作为未知样，依照同样的方法进行分析，测定饮料中的柠檬黄、日落黄、胭脂红3种色素的含量。

三、仪器和试剂

1.仪器

TU－1901双光束紫外可见分光光度计（带有UV Win操作系统，两个1cm石英液槽）

计算机

电子天平

容量瓶　1L1个，100mL 4个，50mL 10个

移液管　10mL 1支，5mL 2支，2mL 3支

烧杯等若干

2.试剂

柠檬黄，日落黄，胭脂红（上海市染料研究所）

美年达橙汁饮料

乙酸铵溶液　1.5g·L^－1：用蒸馏水将1.5g左右的乙酸铵在1L容量瓶中稀释至刻度

色素储备液　200μg·mL^－1：准确称取柠檬黄、日落黄、胭脂红色素粉末各0.0200g，分别用适量乙酸铵溶解，转移至各自的100mL容量瓶中，用乙酸铵溶液定容，备用

四、实验步骤

1.开机、设定参数

打开分光光度计电源开关，一般需提前30min开机预热。在Windows操作系统中［开始］菜单下选择“程序→紫外窗口→TU－1901UVWin”即可启动TU－1900紫外窗口控制程序，进入光度计自检过程，自检无误后进入主工作程序。

选择“应用”菜单下的“光谱测量”，进入光谱扫描窗口，选择“配置”菜单下“参数”进入参数设置界面。设置如下参数，［波长（nm）］，开始：600；结束：350；扫描：中速。［纵坐标范围］，低：0.0000，高：0.1000（根据所测样品的吸光度大小来设），光度方式：Abs。［扫描］，次数：1，采样间隔：5.0nm。

选择“配置”菜单下“仪器”进入仪器设置界面，设置如下参数，氘灯：on；钨灯：on；吸光度位数：0.0000；光谱带宽（nm）：2nm；响应（s）：0.2；换灯波长（nm）：359。

TU－1901双光束紫外可见分光光计的操作使用详见实验9附录。

2.模拟试样中色素浓度的测定

（1）试样的配制

1）模拟试样。分别移取色素储备液柠檬黄16mL、日落黄5mL、胭脂红13mL于100mL容量瓶中，用乙酸铵溶液稀释至刻度，摇匀。

2）0号样。分别移取色素储备液柠檬黄1.6mL、日落黄0.5mL、胭脂红1.3mL于50mL容量瓶中，用乙酸铵溶液稀释至刻度，摇匀。

3）1～9号样。用10mL移液管分别移取10mL上述模拟试样于1～9号的50mL容量瓶中，并依照下列表格，在各容量瓶中分别加入一定体积的色素储备液，后用乙酸铵溶液稀释至刻度，摇匀。

（2）吸光度测量

以蒸馏水为参比，乙酸铵溶液为空白样，先进行基线校正（点击Baseline），后扫描0～9号试样（点击Start），并保存数据为光谱文件（＊.spd）。

（3）数据处理

用记事本打开上面的光谱文件，将其中的吸光度值通过复制、粘贴转入一个excel文件中，将0号样的吸光度在“sheet1”中粘贴9次，组成一个每列相同的矩阵，9列51行；在“sheet2”中依次粘贴入1～9号样的吸光度，得9列51行的矩阵；在“sheet3”中手工输入上表中的浓度增量矩阵（3列9行）。（此处可用体积表示。）

打开MATLAB软件，首先进行矩阵的输入：

输入A0＝［粘贴入excel文件中sheet1的数据］后，按Enter；

输入A＝［粘贴入excel文件中sheet2的数据］后，按Enter；

输入C＝［粘贴入excel文件中sheet3的数据］后，按Enter；然后进行转置：

输入A0＝A0′后，按Enter；输入A＝A′后，按Enter。最后进行运算：

输入A2＝A－A0，按Enter（得吸光度增量矩阵）；

输入B＝inv（C′＊C）＊C′＊A2，按Enter（得吸光系数矩阵）；

输入C0＝A0＊B′＊inv（B＊B′），按Enter（得最后浓度矩阵，用体积含量表示）。

3.饮料中色素浓度的测定

另取新的0～9号50mL容量瓶，分别加入4～5mL美年达橙汁饮料，并按照上表在1～9号瓶中加入规定量色素储备液，用乙酸铵溶液稀释到刻度，分析方法同上。

4.关机

测量工作结束后，退出系统。先关闭TU－1901软件，再关闭分光光度计。处理好数据后，退出Windows系统，关闭电源。