流式细胞术数据分析

第三节　流式细胞术数据分析

目前，流式细胞仪数据的储存方式均采用列表排队，因流式细胞仪所采集的都是多参数指标，荧光标记物参数已达4个，采用列表方式可以大量节约内存和磁盘储存空间。当一个细胞被检测4个参数时，若获取1万个细胞，所占容量为41万个字节。当只检测细胞的一个参数（如DNA）时，可灵活地关闭其他3个参数，节约3/4的空间。数据显示通常有一维直方图、二维散点图、等高线图或三维立体视图等几种。

一、单参数分析

每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以分布直方图来显示（图8－10）。图中x轴表示荧光信号或散射光信号的强度，以通道数表示，通道数也就是模数转换器的位数，它和光强度之间的关系既可以是线性关系也可以是对数关系；图中y轴代表该通道内所出现具有相同光信号特性细胞的频度，一般为相对细胞数，而非绝对细胞数。在直方图中设门确定分析区域后，计算机可根据多选区域的数据进行定性和定量分析，以分析区域内细胞数目、门内细胞百分比和占检测细胞总数的百分比、平均荧光强度的算术平均数和几何均数，细胞的荧光变异系数（CV）、荧光强度中值和峰值道数等统计参量表达。但单参数分析只能表达具有同一特征的细胞数量及其荧光表达的强度，对于复杂的表型分析，单参数分析结果的准确性受到较多因素的干扰。

图8－10　单参数分布直方图

注：图（1）中10⁰～10¹（M1）为阴性细胞，10¹以上的（M2）为阳性细胞；图（2）中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图

二、多参数分析

多参数分析可有效提高分析结果的准确性，从多个角度对细胞的异质性进行研究。对两个以上的参数进行分析时，其表达方式主要为散点图。

图8－11　二维散点图

注：R1＝单核细胞（CD14＋ve）；R2＝淋巴细胞（CD45＞单核细胞）；R3＝中性粒细胞（CD45＜单核细胞）

1.二维散点图　如图8－11（1）所示，y轴代表了SSC的强度，x轴代表了FSC的强度。具有相同细胞特性的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞形成3个独立的细胞群，其中每一个点都具有前向散射光和侧向散射光两个参量的值。实际上该点还有第3个值，即具有相同FSC和SSC值的细胞总数，但散点图无法表达此信息。如图8－11（2）所示，正常人外周血白细胞的FSC和SSC组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞很明显地分为3群，可以很容易地圈“门”（bitmap，无定型门），分析各亚群细胞的数据。

2.二维等高线图和密度图　等高线图是一种可以同时表达检测参量和细胞频度的方式，它类似于地图中所使用的等高线，把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭曲线，越在里面的曲线所代表的细胞数目越多，等高线密集的地方就是细胞数目变化最快的地方，不同的等高线之间的间距既可以是等间距也可以是对数间距。前者适应于细胞数目变化不大的情况，便于观察细节；后者是与细胞变化很大的情况，便于掌握整体。还可以在等高线间加入为彩色，观察更直观。二维密度图则依据细胞分布的密度大小，细胞密度大的地方点的密度大，细胞密度小的地方点的密度小，使数据的显示更直观（图8－12）。

图8－12　二维等高线图和密度图

3.假三维图　并非用来显示3个检测参数，而是在二维双参数的基础上以细胞数目为z轴，展示立体的二维细胞分布［图8－13（1）］。

4.三维图　任意选3个参数（如FSC，SSC，FL1，FL2，FL3）为x，y，z轴构成一个三维图。在三维空间中，每一群细胞各处于独立的空间位置，三维图对复杂的细胞亚群分析更为直观准确，但对数据的统计分析较难［图8－13（2）］。

图8－13　B细胞白血病骨髓细胞免疫分型三维图

5.多参数组合分析　虽然借助计算机，我们可以模拟显示三维空间，同时显示3个参数，但存在观察不方便的弱点，而且在二维的计算机屏幕上更不可能显示四维空间。在现有技术下可以通过设门技术选择特定的观察目标，然后再以多个双参数散点图的组合加以分析。图8－14所示为血液淋巴细胞经过4种荧光素标记单克隆抗体染色后的多参数分析，R1为抑制性T细胞，R2为辅助性T细胞，R3为总T细胞，R4为全部淋巴细胞，R5为单核细胞，R6为中性粒细胞，R7为细胞碎片。通过多参数分析能比较各种细胞的抗原表达水平，需要时可统计出各种细胞亚群的数量或百分比、平均荧光强度等。

图8－14　血液淋巴细胞4色免疫表型的多参数分析

三、关于Gate设置

（一）门的定义

流式细胞分析使用图形化的方式对数据进行显示和分析，其中设门成为流式细胞仪数据分析中最为独特的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而可以获得我们想要的信息。设门是指在细胞分布图中划定一个范围或一个区域，遂一对其中的细胞进行单参数或多参数分析。门的形状包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和四象限门。如图8－14散射光点图中，根据淋巴细胞的FSC和SSC特点设门，在荧光散点图中，仅对门内淋巴细胞进行免疫表型分析，可避免绝大部分其他细胞的干扰。此例设门为散射光设门，另外还有“反向设门”。反向设门应用于FSC/SSC散点图中细胞群间相互重叠的情况。此外，还可根据被标记细胞的免疫荧光特点，在荧光散点图中标记待测细胞群，然后根据标记细胞群的颜色指标在FSC/SSC散点图中找到该群细胞，再作进一步分析。如图8－15下，在荧光散点图中根据CD45/CD14表达水平设定淋巴细胞细胞门R1，由此影射在FSC/SSC散点图中，再画出R2，一般情况下可包含95%以上的淋巴细胞，但其中仍包含少数非淋巴细胞。

图8－15　反向设门分析血液中的淋巴细胞

（二）流式细胞分析设门的策略

1.在线设门　又称实时设门，是指在流式细胞仪获取数据时所限定的散射光和（或）荧光信号的范围。一旦能完成在线设门并收集信号，所获取的数据只具有实时设门范围内的特征，如果设置偏离或不正确，只有重新收集数据。在线设门对需要实时完成的试验，如淋巴细胞亚群和造血干细胞的绝对计数、HLA－B27分析、细胞分选等具有重要意义。

（1）阈值设门：又称入口设门，即在流式细胞仪获取数据时设门，除去那些低水平光学信号。入口设门一般只选择一个参数，可以是光散射或荧光参数。选择哪一个参数有赖于其最佳的信噪比，即噪音和信号能够很好地分离。此外，所选参数还必须是每一个测定样品中的细胞或颗粒所共有的信号。常用参数有FSC、SSC、荧光强度等。入口设门方式，虽可较好地应用多种流式细胞分析项目检测，但也有不足之处。在某些情况下，细胞或颗粒的光信号处于特定的范围时，不但需要设置阈值低限，而且需要设置上限才能满足试验需求，此时就需要采用窗口设门。

（2）窗口设门：是指在直方图或散点图中设定一定的散射光或荧光的可接受范围，然后获取其所定义范围的数据。

2.离线设门　又称非实时设门或分析设门，是指在流式细胞仪已获取数据后，通过计算机软件将数据调出，设定不同的散射光和（或）荧光信号范围进行数据分析的设门方式。离线设门可对计算机中存储的数据进行反复的分析，特别适合于一些需要多重设门并进行较为复杂分析的数据，如白血病免疫分型、细胞周期与DNA倍体分析、造血干或祖细胞计数等。尤其是对于一些荧光染色强度不定的样品，可以采用较大范围的散射光阈值设门获取所有信号并储存在计算机中，再进行离线分析，可更好地保存数据的完整性。离线设门有更多的时间去分析储存的所有数据，并可通过各种设门方式，如光散射设门、双连体排出设门、反向设门和多重逻辑设门等，可对数据进行更准确的分析。

设门时，可依据细胞或颗粒在各种图形中的分布特点，画成线状、矩形、圆形、多边形、任意形状的区域（region，R）。在流式细胞分析的双参数图中，常用R表示区域，如R1、R2等（图8－16）。门（G）常常与区对应（如G1＝R1），但一扇门可包含多个区，如G1＝R1＋R2＋R3。在双参数散点图、等高图或密度图中，为了分析阴性阳性细胞比例可通过划十字线，将细胞群分成4部分，使其呈四象限分布，从而统计出双阴性（LL）、双阳性（UR）、单阳性U（L，LR）细胞所占的百分比。

图8－16　离线设门